高纯度质粒DNA大量提取试剂盒（硅胶沉淀法）

高纯度质粒DNA大量提取试剂盒（硅胶沉淀法）

溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱与变性剂，请不要直接接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。

 

保存条件

RNase A：-20℃保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂：室温保存。

若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

产品说明

本产品采用了经典的硅胶纯化及碱裂法技术，用于高纯度质粒DNA的大量纯化。纯化原理是碱裂解细菌后，硅胶液高效可逆地吸附体系中的质粒DNA（高盐、低

pH值），蛋白及其它杂质不被吸附而被除去，被吸附的质粒DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱出来。一次可从100 ml的过夜培养的菌液中提取400-1000 μg

高纯度质粒DNA（OD260/280 = 1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

 

产品特点

• 高效：一次可获得400-1000 μg高拷贝质粒DNA。
• 高纯度：OD260/OD280 = 1.7-1.9。无须再纯化，可直接使用。
• 灵活：菌体提取规模灵活可控。

 

产品用途

• 常规限制性酶切
• PCR扩增
• 转化
• DNA序列测定
• 体外转录

 

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

 

图1  质粒DNA纯化流程图

操作方法

1  收集100 ml菌液。8,000 rpm离心5min，弃上清。尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请倒置干净的吸水纸上。

    注：应根据所培养菌体的浓度与拷贝数确定收集的菌液量。如果菌液浓度过低或低拷贝质粒，可收集2次100 ml菌液，并将菌体沉淀收集到一个离心管中。菌体的体积与质

粒拷贝数参见注意事项。

2  加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置5-10min。

注：初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否对于获得高产量非常重要。

室温静置5-10min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3  加入7.5 ml溶液Ⅱ，立即轻柔地反复颠倒混匀12次。室温放置3min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

    注：若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

            加入溶液Ⅱ后，不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

4  加入10 ml溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀6-10次。此时会出现白色絮状沉淀。

   注：加入溶液Ⅲ后，应立即混匀避免产生局部沉淀。

5  12,000 rpm室温离心12min，收集上清。

6  将上清置于新的50 ml离心管中。按照每25 ml上清液中加入1.2 ml硅胶纯化液的比例，向所获上清中加入硅胶纯化液。反复颠倒混匀6次直至溶液呈现乳状，

室温放置5min。

     注：加入硅胶纯化液的体积，可根据上清液的量等比例调整。

7  12,000 rpm 离心2min，弃上清液。

    注：此时质粒DNA被吸附于硅胶上并沉淀在管底。

 8  加入10 ml 溶液PB，漩涡振荡使硅胶沉淀完全悬浮。12,000 rpm 离心2min，弃上清液。

    注：此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9  加入10 ml溶液W，漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min，弃上清液。

   注：溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

10加入10 ml溶液W，漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min，弃上清液。

11用移液器吸干管底及管壁上残留的液体。打开离心管盖，于室温晾干30min（或者超净台吹干15min）。

   注：此步骤的作用是去除残余酒精，避免降低质粒的生物学活性，影响下游酶促反应。

12加入1.5-2 ml溶液Eluent（65℃预热），漩涡振荡使沉淀完全悬浮。室温放置5min，12,000 rpm离心2min。上清液即为质粒DNA溶液，吸取移至一新离心管

于-20℃保存。

    注：溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5，加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

            对溶液Eluent  65℃预热，会提高提取质粒DNA

的得率。

 

图2  质粒DNA电泳图

注意事项

1  提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量。高拷贝质粒推荐使用量

为100ml，得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200~400μg。溶液Eluent 应在65℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以

适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。

2  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。

3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。

4 溶液 Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。

 

质粒DNA浓度与纯度检测

1  利用紫外分光光度计检测时，OD260值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA。高纯度的质粒DNA OD260/280通常在1.7-1.9 左右。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，

而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值。

2  利用琼脂糖凝胶电泳检测时，理想情况是只出现单一超螺旋条带。然而，再质粒提取过程中，由于机械剪切、酸碱度等原因，使质粒DNA发生断裂。电泳

时可能出现1-3条带，电泳迁移率从大到小，分别为超螺旋质粒、开环质粒或复制中间体。但是，只要质粒DNA经过单酶切鉴定后（单酶切位点），呈现单

一条带，就表明没有基因组DNA的污染。