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- 2025年07月14日
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100
- 供应商：
上海研生
- 规格：
50T
PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。
3：结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强
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/48T实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
定量PCR方法：
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
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文献和实验溶血素“O”（ASO）、抗链球菌激酶（ASK）、抗脱氧核糖核酸酶B（ADNAaseB）、抗辅酶Ⅰ酶（ANADase)、抗透明质酸酶（AH），有一项或多项呈阳性，咽部感染后ASO增高，皮肤感染后AH、ADNAase和ANADasｅ反应阳性；③C3血清浓度短暂下降，肾炎症状出现后8周内恢复正常。症状不明显者必须详细检查，特别应反复检查尿常规方能确诊。 治疗措施 急性肾小球肾炎大多可自愈，因此对轻症病例不必过多用药，可采取下列措施。 （一）休息 休息对防止症状加重、促进疾病好转很重
为了弄清生物体内各种反应的机理，人们必须对生物体内各种蛋白质或者细胞的相互作用进行监控，过去主要用同位素和有机荧光染料标记细胞和生物分子来达到这一目的。但众所周知同位素和有机染料存在一系列的缺陷从而限制了其在生物活体内的应用。量子点的出现解决了这一问题，并大有希望成为新一代生物荧光标记物。 量子点(Quantum dots，QDs)又称半导体纳米晶体（Semiconductor nanocrystal），是一种由Ⅱ-Ⅵ族(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ-Ⅴ族（如InP
上，然后在此探针上以微弱的结合方式杂交一个短小能产生信号的核酸，如果靶DNA能与捕获探针杂交可通过竞争置换出带信号的核苷酸片段，在检测过程中产生信号的单股核酸可转化为ATP,再加入荧光素酶，用生物发光分析法检测。其优点在于背景干扰小，敏感性强。缺点为不是所有捕获探针都能应用这种方法杂交，且信号探针会不断地从捕获探针上脱落。5.3.浸染棒法 （Dipstick assay） 它是夹心杂交法最新的一种改进方法。它用两种探针，其中一个进行标记，另一个是单核苷酸长链，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹与多聚腺苷酸长链探针
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