Long Taq Kit

Long Taq Kit

产品简介

本产品是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Long Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分（模板与引物除外）。使用时，仅需将反应缓冲液与Long Taq DNA聚合酶按比例混合后，在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染（加样次数减少）。同时，由于体系内含有优化剂与增强剂，能够显著增强PCR扩增的灵敏度。

Long Taq DNA聚合酶是专门用于扩增长片段的嗜热DNA聚合酶，其保真性是普通Taq DNA聚合酶的3倍左右。扩增片段的长度可达20 kb（简单模板）。在扩增复杂模板（如GC-rich或重复序列）时，Long Taq DNA聚合酶的扩增效率显著高于Taq DNA聚合酶。因此Long Taq DNA聚合酶适合＞5kb的DNA片段及复杂模板的扩增。延伸速度为20s/kb（70~75℃，简单模板可达5s/kb）。扩增产物具有两种末端：平末端与3'-dA。

产品组成

Component	ZY3062
2× Long Reaction Mix	1 ml×5
PCR Enhancer [1]	500 μl×3
Long Taq DNA聚合酶（2.5U/μl）	160 μl

本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品，PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如没特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。

[1] PCR Enhancer主要通过降低DNA模板的解链温度，促进DNA模板的有效扩增，增加PCR反应的灵敏度和特异性。可单独订购。

活性定义

一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测：PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：

Ordinal	Component	Volume (50 μl reaction volume)	Final concentration (50 μl reaction volume)
optional	PCR Enhancer	4-16 μl	-
1	2×Long Reaction Mix	25 μl	1×
2	upstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
3	downstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
4	Long Taq DNA聚合酶（2.5U/μl）[2]	0.5-1 μl	1.25U-2.5U
5	template DNA[3]	1-4 μl	<1μg
6	超纯水[4]	To 50 μl	-
optional	MgCl2(MgSO4)	Variable	-
optional	PCR Enhancer	4-16 μl	-

[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建议用量如下表（50 μl反应体系）。

Template	Dosage
人类基因组DNA	0.1μg-1μg
λDNA	0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA	10ng-100ng
质粒DNA	0.1ng-10ng

[4] 可单独订购超纯水。

[5] 可单独订购25mM MgCl₂。

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage	Temperature	Time	Number of Cycles
Initial Denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	30 sec	25-35
Annealing	55-68℃[1]	30 sec
Extension	72℃	Variable[2]
Final Extension	72℃	5-10 min	1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按20s/kb来设最佳（简单模板可达5s/kb）。

3. 分析结果

反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要，可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有：1调整退火温度；2减少抑制剂的影响，如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分，需要高倍稀释（1:；10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脱，提高模板DNA的纯度；4使用PCR添加剂，如PCR Enhancer、MgCl₂等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下Long Taq DNA聚合酶有一定的活性，为避免发生非特异性扩增，请于冰上配置反应体系，并且最后添加Long Taq DNA聚合酶或模板DNA。

2 Long Taq Kit的扩增产物有两种末端：平末端和3'-dA突出末端。如要进行TA克隆，请先进行加A反应，以提高克隆效率。（加A反应：参考如下体系，72℃，15-30min）

PCR（纯化）产物	1-7 μl
10× Taq Buffer（Mg2+Plus）	1 μl
dATP	0.2 mM
Taq DNA聚合酶	5U
超纯水	To 10 μl

3 Long Taq Kit既可扩增长片段的DNA，也可扩增小片段（几百bp）的DNA。

4 PCR Enhancer主要在Long Taq Kit扩增无结果或扩增效果不好时使用。使用后退火温度需在原温度上降低2-3℃，否则会降低PCR效率，建议使用Tm值较高的引物。PCR Enhancer能够与所有的耐热DNA聚合酶共同作用。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间；上下游引物3’末端避免互补，避免出现3个以上重复的G或C，或出现发夹结构，否则会产生非特异性扩增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量尽量接近；Tm值控制在55-65℃之间，且上下游引物Tm值尽量接近，额外附加序列（酶切位点、修饰等）是非模板匹配序列，不参与Tm值计算。