细菌基因组DNA快速提取试剂盒
● 裂解液MS中含变性剂,请不要直接接触皮肤。
● 漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
产品说明
本产品用于细菌基因组DNA的小量提取。其纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA,经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质等杂质后,用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从0.5-2 ml对数生长期的菌液(不超过106–108 个)中提取到3-20μg 超纯基因组DNA(OD260/280 = 1.7-1.9),此基因组DNA可直接用于酶切、PCR等后续实验。
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷贝基因的PCR扩增鉴定。
保存条件
蛋白酶K室温运输,于-20℃保存,避免反复冻融。
其余试剂置于室温(15-25℃)干燥条件下保存1年。
如果消化缓冲液DS和MS中有沉淀,可在55℃加热溶解,待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA的纯化效率。
注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
● 漂洗液PE第一次使用前请按瓶上标签加入3倍体积的无水乙醇,即15 ml漂洗液PE加入45 ml无水乙醇,30 ml漂洗液PE加入90 ml无水乙醇,使用后立即盖紧盖子。
● 消化缓冲液DS和裂解液MS室温保存可能会有沉淀产生,在55℃加热溶解,待恢复至室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA纯化效率。
● 应尽量使用新鲜的菌体,确保提取的基因组DNA不被降解。
● 在操作步骤4中,菌体应充分悬浮,不要残留菌块,避免影响溶菌效果。
● 在操作步骤5中,加入无水乙醇后,可能会出现絮状沉淀,应将离心管内的溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中,确保基因组DNA的得率。
● 基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化液TE。用无菌的离心管分装后保存于-20℃或-80℃。
● 所有离心步骤均为室温下进行。
● 请严格按照操作步骤操作。
操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1 取0.5-2 ml处于对数生长期菌液,置于1.5 ml离心管中。12,000 rpm离心1min,弃上清。
2 向收集到的菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液DS,用涡旋振荡器剧烈振荡直至菌体彻底悬浮。
● 对于较难破壁的革兰氏阳性菌,需加入溶菌酶消化细胞壁后,再进行基因组DNA的提取。具体方 法为:向步骤1收集到的菌体中,加入108 μl消化缓冲液DS和72 μl的50 mg/ml的溶菌酶,振荡混匀。37℃处理30min以上。
● 如需要去除RNA,加完消化缓冲液DS或溶菌酶后,加入4 μl RNase A(100 mg/ml,N9042)溶液,振荡混匀,室温放置5min。
3 加入20 μl蛋白酶K溶液,55℃水浴或金属浴30min。
4 加入220 μl裂解液MS,涡旋振荡混匀,直至形成均一的悬浮液,65℃温浴10min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠,室温放置5min使溶液冷却。
● 加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细菌细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA 不纯。
● 如菌体超过1.5 ml,可适当延长温浴时间。
5 加入220 μl无水乙醇,上下颠倒混匀,此时可能出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 若溶液体积大于纯化柱容积(700 μl),可分两次离心。
● 此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
● 如柱子堵塞表明菌体过量。若发生此情况,减少菌量,或适当延长离心时间,直至洗脱液顺利离心至离心管为止。
6 加入500 μl去蛋白液PS,12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 此步骤的作用是去除硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质,以获得高质量基因组DNA。
7 加入500μl漂洗液PE,12,000 rpm离心1min,弃滤液。
● 漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
8 加入500 μl漂洗液PE,12,000 rpm离心1min,弃滤液,12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
● 此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
9 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加30-100 μl洗脱液TE。室温放置2min。
10 12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。
● 洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。
● 对洗脱液TE 65℃预热,会提高基因组DNA的产量。