五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）

致泻大肠埃希氏菌鉴定剂盒（PCR 法）
u 产品说明
病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为 103 CFU/ml。
◆ 产品组成（96 测试）
试剂 含量 作用
孔 1 反应液-uidA
23μl/孔
12 孔/排
8 排
（本产品使用 12 联PCR 管分装，每排含12 种反应液各 23ul）内参
孔 2 反应液-ipaH 鉴定 EIEC
孔 3 反应液-pic 鉴定 EAEC
孔 4 反应液-aggR 鉴定 EAEC
孔 5 反应液-astA 鉴定 EAEC
孔 6 反应液-stx1 鉴定 EPEC 与 EHEC
孔 7 反应液-stx2 鉴定 EPEC 与 EHEC
孔 8 反应液-bfpB 鉴定 EPEC 与 EHEC
孔 9 反应液-escVa 鉴定 EPEC 与 EHEC
孔 10 反应液-lt 鉴定 ETEC
孔 11 反应液-stp 鉴定 ETEC
孔 12 反应液-sth 鉴定 ETEC
NG-Ecoli 100μL × 1 支 阴性对照
NG-DW 100μL × 1 支 空白对照
PG-Ecoli 100μL × 1 支 阳性对照
Loading Buffer 600μL×1 支 电泳上样缓冲液
◆ 所需仪器
ABI ，BioRad，TaKaRa 等 PCR 扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量 PCR 仪进行定性判读时则无需电泳设备）
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②冰盒；③移液器
部加样品 2，第五排全部加 PG-Ecoli。盖好配套的 PCR 管盖后，涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行 PCR 扩增反应。
2. 扩增反应（扩增及产物分析区）
按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择 FAM 通道）
PCR 循环 荧光收集位点
95℃ 10 分钟 1 个循环 —
95℃ 30 秒
30 个循环
—
63℃ 30 秒 —
72℃ 90 秒 ※
72℃ 5 分钟 1 个循环 —
3. 产物电泳（扩增及产物分析区）
称量 4. 0g 琼脂糖粉，加入至 200 mL 的 1×TAE 电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至 60℃左右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为 0.5μg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于 10cm，厚度宜为 3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液，液面高于胶面 1mm~2mm。将5μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源，根据公式：
电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳 30min~45min 后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。
u 可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸荧光染料替代 EB。
u 推荐使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 条带的 Marker。 
◆ 结果分析
1. 阴阳性判读：
进行电泳检测时，需对比 Marker 进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性；否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量 PCR 仪检测时，检测孔 Ct≤30 时判断该孔为阳性；当检测孔 Ct＞30 时，该检测孔为阴性）
示例电泳图
2. 有效性判读：
需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中 uidA 泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。
3. 结果判读：
在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：
致泻大肠埃希氏菌类别 目标条带的种类组合
EIEC ipaH（＋）
uidA
（＋／－）
EAEC aggR，astA，pic 中一条或一条以上阳性
EPEC bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）
STEC/EHEC stx1，stx2 中一条或一条以上阳性，eae（＋／－），bfpB（－）
ETEC lt，stp，sth 中一条或以上阳性
u 97%以上大肠埃希氏菌为 uidA 阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；
u 当结果判定为 EPEC 阳性时，若 bfpB 靶标为阳性则说明样品含有典型 EPEC；若 bfpB 靶标为阴性则说明样品为非典型 EPEC；
u 当结果判定为 STEC/EHEC 阳性时，若 eae 靶标为阳性则说明样品含有典型 EHEC；若 eae 靶标为阴性则说明样品为非典型 EHEC。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30秒。
5．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。