K1423快速DNA连接试剂盒进口直销

【交流】关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答

连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。 另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。 图1：在25°C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 µl）T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图

PCR产物克隆(10)

酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。1. Add 1ml of TOPO®

实验操作篇

1. 质粒载体构建不成功（目的片段和载体不能成功连接）的常见原因分析   ①DNA 片段纯度差：体系中的杂质会降低连接效率，如果使用不纯化直接连接的方法一直无法成功构建载体，可以考虑进行纯化后再进行连接； ②目的片段和载体片段使用比例悬殊，或者用量过多或过少：目的片段和载体的摩尔比需要控制在一定范围之内，否则会影响连接效率，具体比例可以草靠连接酶说明书； ③连接条件不当：比如连接时间不足、温度不合适、酶失活等，可以通过设置对照组来排查原因； ④引物设计问题：比如通过无缝克隆的方式进行连接，同源