零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性)

特别提示：包括零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性)
英文名称：Blunt Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)
产品货号：BTN160684A
产品规格：25次

本产品是基于Topoisomerase能够在几秒钟之内高速连接DNA片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶，连接效率比野生型更高。

产品特点：
1. 高效快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到100%。
2. 适用于pfu、KOD等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 零背景，无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal培养基。
5. 本试剂盒按10μl标准反应体系。
6. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择（BTN160684A是含Amp抗性TOPO载体，BTN60684K是含Kan抗性TOPO载体）。

产品组成：

组分	编号	规格
TOPO-Amp Blunt载体	BTN160684A	25μl
连接缓冲液	BTN160684B	25μl
M13F引物		50uL
M13R引物		50uL
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃，有效期一年。

自备试剂：DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）

使用方法：
1. 如果是PCR制备插入片段，所用引物不能磷酸化，使用pfu、KOD等产生平末端片段的高保真DNA聚合酶。为保证扩增产物的完整性，PCR循环结束后，再延伸5-10分钟，确保片段延伸完全。
2. 电泳检测并相对定量PCR片段（跟DNA marker比较）。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的zuì佳用量：

插入片段长度	zuì佳用量
100-1000bp	20-50ng
1000-2000bp	50-100ng
2000-5000bp	100-200ng

3. 在一个干净的塑料离心管中，室温下（不要放在冰上）设置如下连接反应体系：

加入物	加入量
纯化后的PCR产物	不超过8μl
TOPO-Amp Blunt载体	1uL
连接缓冲液	1uL
超纯水	补到10uL

  注意：如果使用未经纯化的PCR产物，则需要加入量不能超过1μl，否则PCR体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后，短暂离心，常温（20-30℃）放置0-5分钟。如果在冬天室温低于20℃，建议使用25℃水浴或金属浴。注意：连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化，可以将离心管放-20℃保存。如果转化，则取5μl连接液加到50-100μl刚刚融化的感受态细胞中，轻柔混匀。
  注意：本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb，则不需要冰浴和热激，直接在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上，37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb，则按常规转化方式，先冰浴2-30分钟，然后42℃热激30秒，冰上防放置2分钟，再在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，37℃ 250rpm培养60分钟，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Amp的培养皿上，37℃过夜培养。
8. 用M13F/M13R通用引物进行菌落PCR或直接测序来鉴定重组子。

该载体的多克隆位点序列：


通用测序引物序列：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

除了零背景平末端克隆试剂盒(Amp抗性),，我公司还供应以下相关产品：



名称：cl857 Sam7 λDNA(非甲基化)
货号：BTN90407C
规格：5μg
本产品Lambda DNA(λDNA)为λ噬菌体中的DNA，是一种常见的DNA底物，分子量为31.5×106Da/48502bp，浓度为200～500μg/ml。A型为普通Lambda DNA。B型为不含N6-甲基腺嘌呤Lambda DNA。C型为非甲基化的cl857 Sam7 λDNA，是从感染的大肠杆菌GM119菌株中分离得到的。该菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性。非甲基化的λDNA以作为对DNA甲基化敏感的限制性酶的底物。

储存溶液：Tris-HCl(pH8.0)10mM；EDTA 1mM

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

纯度：
1. OD260nm/280nm＞1.8。
2. 琼脂糖凝胶电泳出现清晰单一条带。
3. 1μg的λDNA在Hind III酶切Buffer中37℃保温16小时后，琼脂糖凝胶电泳时出现清晰单一条带。
4. 1g的λDNA 用Hind III酶切(37℃，2小时)后，在琼脂糖凝胶电泳时出现8条清晰的DNA电泳带。

名称：TE Buffer
货号：YT415
规格：100ml
本品为10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0的buffer，常用分子生物学试剂，用于DNA的溶解等。

储存条件：室温。

名称：STAT3荧光素酶报告基因质粒
货号：YT455
规格：1μg
STAT3报告基因质粒是用于检测STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)转录活性水平的报告基因质粒。STAT3质粒是以pGL6-TA质粒为模板，在其多克隆位点插入了多个STAT3结合位点，可以高灵敏度地检测STAT3的激活水平。

pGL6-TA质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫萤光素酶报告基因检测的新一代质粒。该报告基因质粒比Promega公司的pGL3系列有了全面的改进，一方面对于luciferase的编码进行了改进，确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达，同时对整个质粒中所有可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理，在保持原有功能不变的情况下，使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到zuì低。

STAT3质粒的主要信息如下：
 

Base pairs	5672
STAT3 response element	32-86
Minimal TA promoter (pTA)	109-131
luc2 reporter gene	173-1825
SV40 late poly(A) signal	1860-2081
SV40 early enhancer/promoter	2129-2547
Synthetic neomycin phosphotransferase
(Neor) coding region	2572-3366
Synthetic poly(A) signal	3391-3439
Reporter Vector primer 4 (RVprimer4) binding region	3506-3525
ColE1-derived plasmid replication origin	3763
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region	4554-5414
Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site	5519-5672
Reporter Vector primer 3 (RVprimer3) binding region	5621-5640

STAT3质粒的图谱如下：



使用说明：
1. 首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2. STAT3质粒可以用常规的细胞转染方法转染细胞。检测时可采用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(YT271)或双萤光素酶报告基因检测试剂盒（YT273）。
3. 可以激活STAT3的试剂，可以用作STAT3报告基因检测时的阳性对照。

储存条件：-20℃。