持久性化学发光底物 ECl化学发光试剂盒

产品信息
 

产品描述
本试剂盒持久性化学发光底物(SuperSignal SuperDura Extended Duration Substrate)采用了独特的发光/增强底物系统，可实现中等飞克级的免疫印迹检测。除用于X光片，还可通过CCD成像仪检测。

翌圣ECl系列发光试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体及其关联的抗原。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配制的ECL工作液，室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数小时，显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。

产品特点

1）具有极高灵敏度和高信噪比，可检测中等飞克级抗原；

2） 信号可持续24小时，发光时间比常规ECL底物长10倍以上；可通过多次曝光获得用于发表论文的高品质印迹图像；

3）可使用较高的抗体稀释倍数，大大节省抗体：

一抗（储液浓度1mg/ml）稀释倍数：1:1000-1:50000；

二抗（储液浓度1mg/ml）稀释倍数：1:50,000-1:250,000。

产品组分

运输与保存方法

常温运输。4 ºC保存。【注】：A液（36223-A）需避光保存！有效期1年。

操作方法
【较理想的Western blot 结果需要优化所涉及的各个实验环节，如样品上样量、凝胶类型、转膜方法、膜类型、封闭试剂、一抗浓度、二抗浓度及相应孵育时间等。另外，每个环节尽量提供足量的孵育试剂，以避免膜干燥。】

1. 执行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或者HRP标记核酸探针孵育、洗膜。
注：ECL发光液是HRP的显色底物，因此检测系统最终必须基于HRP酶标记抗体或者核酸探针。
2. 最后一次洗膜的同时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的A液和B液，混匀后，室温放置备用。
注：取A液和B液一定要用不同的枪头；
3. 用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（100~200μl发光工作液/cm²膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3-5分钟，准备立即压片曝光。
注：孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小，但勿降低发光液使用比例。
4. 用平头镊子夹起膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不可让膜完全干燥。不可洗去发光液。
5. 在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。
6. 暗房内取一张X光胶片至于包裹的膜上，压片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟，定影显影冲洗。
注：曝光时间需根据曝光强度做相应的调整。若是背景过高，可使用两张X光胶片同时压片。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）步骤1～5可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的干净。

3）长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。
4）发光工作液孵育约3-5分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因此弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。
5）由于发光液灵敏度高，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗（储液浓度1mg/ml）稀释倍数：1:1000-1:50000；二抗（储液浓度1mg/ml）稀释倍数：1:50,000-1:250,000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败。

6）某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。

7）避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜，相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。

8）使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

9）使用生物素-亲和素系统，避免使用牛奶封闭，可能会导致背景过高。

10）金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点，避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子，建议使用塑料的平头镊子。

11）Sodium azide（NaN₃）能抑制HRP活性，若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN₃。

12）本品无特殊毒性，按普通化学品处理。

附 常见问题及解答