动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒

特别提示：包括动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒
英文名称：Animal tissue/cell Mitochondrial DNA Extraction Kit
产品货号：XH008
产品规格：50T|100T

本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，zuì后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

试剂盒组成：

组份	50T	100T
细胞裂解液	50mL	100 mL
线粒体清洗液	25 mL	50mL
DNA酶I	12mg	22mg
DNA酶反应液	6ml	12ml
线粒体裂解液	10ml	20ml
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml
核酸助沉剂	0.5ml	1ml
TE缓冲液	15ml	30ml

保存条件：2～8℃可保存一年。使用前，在DNA酶I中加入600μl（50T）或者1100μl（100T）的DNA酶反应液，分装后-20度保存。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37度水浴溶解，不影响使用。

操作步骤：
准备工作：在DNA酶I中加入600μl（50T）或者1100μl（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20度保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2～8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但zuì后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1．样本处理
a．组织匀浆：称取100～200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；
b．培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800×g 5～10min离心收集细胞。计数。每次提取需要5×10⁷个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；
2．将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g离心5min；
3．取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g再次离心5min。
4．取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
5．在线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；
6．取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
7．加入100μl DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μl DNA酶I溶液（见准备工作），混匀，37度水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12,000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μl TE重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的DNA酶。
8．得到的沉淀，用100μl TE重悬线粒体沉淀。加入200μl线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置2min左右，不超过5min，再加入150μl蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
9．取上清，加入一新的离心管中（可选用等体积的酚氯仿异wù醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可省，并不影响后续的PCR），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA）及10μl核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，12,000×g离心10min。
10．弃上清，再加入1ml 70%乙醇，4℃，12,000×g离心10min。重复用70%乙醇洗一次。
11．弃上清后再次离心1min吸弃上清，开盖凉干约5-10分钟。
12．加入20-30μl TE缓冲液,轻弹管底，37度水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
13．进行DNA电泳检测及-20度保存，进行下步的实验。

注意事项：
1．为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2．线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
3．以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]²即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。

我公司销售的动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒质量上佳，价格普惠，欢迎广大新老客户踊跃订购。