一步法荧光定量RT-PCR MasterMix(TaqMan

特别提示：包括一步法荧光定量RT-PCR MasterMix(TaqMan)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步法荧光定量RT-PCR MasterMix(TaqMan)
英文名称：2×One-step TaqMan RT-PCR Mix

产品货号：一步法荧光定量RT-PCR MasterMix(TaqMan)
产品规格：200T|5000T

本产品常用于RNA的相对定量检测，采用TaqMan探针进行Real-Time PCR的专用试剂，可在单管中完成由RNA到定量PCR。试剂中包含热启动Taq DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP、MLV、Rnase Inhibitor等试剂预混在一起，是一种2×浓度的单组分预混试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单，只需加入上下游引物、探针、RNA模板、水即可。制品中的反转录反应依赖于PCR扩增的反向引物，无需加入随机或Oligo dT引物。

本产品配有单独的ROX内参染料，使得该试剂可应用于所有RealTime PCR 机型，包括：ABI 7000/7700/7900HT, 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)；LightCycler（Roche Diagnostics) ；Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad&MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。

产品特点：
1．反转录和PCR单管扩增，一步完成。
2．热启动酶采用化学修饰，100%热启动。
3．单组份预混液，使用方便快捷。
4．高特异性，有效抑制非特异性扩增。
5．适用于所有实时定量PCR仪器。

产品组成：

组分	200T×20μl	5000T×20μl
2×One-step TaqMan RT-PCR Mix	1ml×2	50ml
50×ROX Reference Dye	200μl	2ml

保存条件：-20℃保存，有效期三年。(经常使用，融化后可置于4℃，可保存1年。长期-20℃保存可能会出现沉淀，室温融化后混合均匀，不影响试剂性能。)

操作方法：

1．根据机型选择步骤A或B
A：需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×One-Step TaqMan RT-PCR Mix	10μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
TaqMan探针(10μM)	0.4μl	0.2μM
RNA模板	1~200 ng
ddH2O	Up to 20μl

B：无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×One-Step TaqMan RT-PCR Mix	10μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
TaqMan探针(10μM)	0.4μl	0.2μM
RNA模板	1~200 ng
ddH2O	Up to 20μl

2．进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：
 

加入物	加入量	终浓度	循环数
Stage 1:	50℃	5分钟
Stage 2:	95℃	30s
Stage 3:	95℃	10s	35~40
	60℃	45s

3．反应结束后确认 Real-Time PCR的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。

除了一步法荧光定量RT-PCR MasterMix(TaqMan),，我公司还供应以下相关产品：



名称：10nt随机引物(0.5μg/uL)
货号：BTN131227
规格：250
本产品为长度为10nt的随机引物，序列为5´-(NNNNNNNNNN)-3´，主要用于cDNA的合成和DNA探针标计。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

疑难解答：
Q: 随机引物的长度对cDNA合成有何影响？
A: 文献报道，长度为10个nt的随机引物合成cDNA的效果好于6nt长的随机引物。

名称：防污染多重PCR MasterMix(含UNG酶)
货号：WE0126
规格：1ml
  本品是由BaldStar Taq DNA Polymerase、Mg2+、dNTPs(含dUTP)、UNG酶以及PCR稳定剂等组成的PCR预混体系。使用本产品无需进行繁杂的PCR反应条件的优化过程，只需进行简单的条件摸 索即可轻松进行多重PCR反应。
  本产品所含的BaldStar Taq DNA Polymerase是经化学修饰的热启动酶，可以有效 减少PCR反应初期因引物错配而产生的非特异扩增。独特的缓冲体系，使多重PCR反 应所有的引物都能有效延伸，无需额外优化。此MasterMix中还包含GC Enhancer，有 助于实现“困难”模板(比如，高GC含量的模板)的高效扩增。本产品运用dUTP-UNG 防污染系统，可有效去除了PCR产物的残留污染，大大降低了由于扩增产物污染而导 致的假阳性。UNG酶在PCR循环中的预变性步骤即可被灭活，因此不会影响新的含dU 碱基PCR产物的形成。
  本品可有效防止PCR产物的残留污染，适用于防污 染多重PCR反应，比如微卫星分析、基因分型和SNP检测等。


名称：一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(荧光探针)
货号：WE0147
规格：100次
  本试剂盒是采用探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

试剂盒组成：

组份	100次
2×Super TaqMan OneStep Buffer	1.4ml
Super OneStep Enzyme	100μl
RNase-Free Wat er	1ml

注意事项：
1、本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙*(代"酯"))水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5、本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。

使用方法：
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)

1、将RNA模板、引物、2×Super TaqMan OneStep Buffer、Super OneStep Enzyme和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系：
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×Super TaqMan OneStep Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Probe，10μM	0.5μl	0.2μM
Super OneStep Enzyme	1.0μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常RNA模板的量以10 pg-100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。

3、混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-PCR反应条件：

步骤	温度	时间	循环数
逆转录	45℃	20 min
PCR预变性	95℃	2-5 min
变性	95℃	15 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	30-45 s

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、2-5 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融