线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒 可见分光光度法

线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1440
规格：25T/12S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体15 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体15 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1支	-20℃保存
试剂三	液体6 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体3mL×1瓶	2-8℃保存
试剂五	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂六	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂七	液体10 mL×1瓶	常温保存
标准品	液体1 mL×1支	2-8℃保存

溶液配制：

1. 试剂二：临用前每支加入1.11 mL双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；
2. 试剂五：临用前加入10 mL双蒸水，充分溶解；-20℃可保存4周；
3. 试剂六：临用前加入10 mL水，充分溶解；2-8℃可保存4周；
4. 标准品：10 μmol/mL磷标液，临用前取50μL 10 μmol/mL磷标液，加入1950μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.25μmol/mL标准液使用，现用现配（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积）；
5. 定磷试剂的配制：根据用量将H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=20mL:10mL:10mL:10mL（约50T）混合备用，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
产品说明：
线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F₁和F₀两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
  
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器及用品：
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体的操作步骤请见“产品资料”文件

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。
2. 测定胞浆时，定磷后反应液可能会有絮凝产生，测定前混合均匀即可，并不影响测定结果。
3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4. 本试剂盒试剂足够完成25管反应。
5. 附:使用样本质量计算公式：（样本检测数为25T/6S）

1. 上清中复合体Ⅴ活力的计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA1÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷（W÷V提取×V样本）÷T
=20×ΔA1÷ΔA标准÷W
ΔA1：上清测定值；C标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V提取：加入提取液体积，1.0mL；V样本：样本体积，0.2mL；V酶促：酶促反应总体积，0.48mL；T：反应时间，30min。
B、沉淀中复合体Ⅴ活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA2÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷（W÷V提取×V样本）÷T
=12×ΔA2÷ΔA标准÷W
ΔA2：沉淀测定值；C标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V提取：沉淀重悬体积，0.6mL；V样本：样本体积，0.2mL；V酶促：酶促反应总体积，0.48mL；T：反应时间，30min。
C、样本复合体Ⅴ总活力的计算：
样本复合体Ⅴ总活力即为上清中复合体Ⅴ活力与沉淀中复合体Ⅴ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W+12×ΔA2÷ΔA标准÷W
实验实例：

1. 取0.1g兔子肾脏进行样本处理，上清液和沉淀都稀释8倍后按照测定步骤操作，测得ΔA标准=A标准管-A空白管=0.562-0.001=0.561，上清液的ΔA1= A测定管-A对照管=0.537-0.177=0.36，沉淀的ΔA2=A测定管-A对照管=0.558-0.044=0.514，则按样本质量计算得：上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×8（稀释倍数）=1026.74 U/g 质量沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA标准÷W×8（稀释倍数）=879.57 U/g 质量复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×8+12×ΔA2÷ΔA标准÷W×8=1906.31 U/g 质量。
2. 取0.1g冬青进行样本处理，上清液和沉淀都稀释2倍后按照测定步骤操作，测得ΔA标准=A标准管-A空白管=0.562-0.001=0.561，上清液的ΔA1= A测定管-A对照管=0.927-0.580=0.347，沉淀的ΔA2=A测定管-A对照管=0.636-0.187=0.449，则按样本质量计算得：上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×2（稀释倍数）=247.42 U/g 质量沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA标准÷W×2（稀释倍数）=192.09 U/g 质量复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×2+12×ΔA2÷ΔA标准÷W×2=439.51 U/g 质量。

相关发表文献：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;
2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine,2019,134:229-238.

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