植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒 可见分光光度法

植物脱氢酶（PDHA）
活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号: BC3120
规格: 50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	粉剂×2瓶	2-8℃保存
试剂二	液体100 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体100 mL×1瓶 (自备)	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂一：使用前加少量水溶解，定容至30 mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）；
2. 试剂三：自备乙酸乙酯。提供一60mL棕色试剂瓶。

产品说明：
生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase , PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。
受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（Triphenyl Formazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、冰、研钵/匀浆器、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。
二、测定步骤

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。
2. 操作表：取5mLEP管依次加入

加入试剂	对照管	测定管
样本（g）	0.1	0.1
试剂一（mL）	-	1
试剂二（mL）	2	1
充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样本，置于研钵/匀浆器中。
试剂三（mL）	1	1
充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取上清，测定485nm下的吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。

三、脱氢酶活力计算
酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样本使反应体系吸光值每增加0.01为一个酶活单位。
脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.01÷T÷W=33×ΔA÷W
T：反应时间，3h；W：样本质量，g。
注意事项：

1. 配制好的试剂一避光保存于4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。
3. 反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。
4. 如果测定出来的吸光值较大，需把样本适当稀释再进行测定，注意计算公式乘以稀释倍数。

实验实例：

1. 称取1g芦荟叶片，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，按照测定步骤进行操作，测得计算ΔA=A测定-A对照=0.120-0.012=0.108，计算酶活得：

脱氢酶活性（U/g/h）=33×ΔA÷W=3.5964 U/g/h。
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