Theileria equi马泰勒梨形虫(原Babesia

Theileria equi马泰勒梨形虫(原Babesia equi)探针法荧光定量PCR试剂盒马匹的梨形虫病是一种由蜱传播的感染性、非接触性血液原虫寄生虫病，致病原为马泰勒虫（原马巴贝斯虫 Babesia equi）。可感染马、驴、骡及斑马，侵犯宿主红细胞，引起不同程度的溶血性贫血。若马匹感染泰勒虫后未采取相应的治疗措施，感染马匹将呈终生持续感染状态。马匹感染梨形虫若呈慢性感染经过，则很少表现出临床症状，这也是梨形虫病容易被忽视的重要原因。马梨形虫病在全球范围内流行，尤以适宜虫媒蜱生存的热带和亚热带地区为主。由梨形虫的流行感染所引起的马匹流产死亡、高额的治疗费用以及对疫区马匹国际运输及参赛的限制，都对马业造成了极大的经济损失。因此快速灵敏检测马泰勒梨形虫具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测马泰勒梨形虫的试剂盒，它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。 2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。 3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 4. 特异性高，引物是根据马泰勒梨形虫高度保守区设计，不会跟其他寄生虫的 DNA 发生交叉反应。 5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。 6. 本产品只能用于科研。
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。 1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。 2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。 3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备 7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。 8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 DNA 提取的天净沙核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。
如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板）， 1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。 13. 如果把Theileria equi马泰勒梨形虫(原Babesia equi)探针法荧光定量PCR试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于 或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如 果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。