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- RNA Pulldown、DNA Pull-down
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晶莱生物
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RNA Pulldown、DNA Pull-down
- 规格：
RNA Pulldown、DNA Pull-down
实验意义
核酸与蛋白质的互作是细胞功能的核心，包括蛋白质合成、mRNA组装等生命活动中重要的代谢过程，研究核酸与蛋白质的互作是研究生命科学的基本工具。
RNA/DNA pull down是研究体外条件下RNA或DNA与蛋白互作的重要技术。该技术通过体外转录目的RNA的一部分或全长，用生物素标记转录产物，再与链霉亲和素磁珠孵育使之固定在磁珠上，用以“pull down”互作蛋白，纯化的产物蛋白经特定抗体的western-blot实验，可验证某种蛋白与目的RNA/DNA是否有相互作用；纯化的蛋白经质谱鉴定，即可筛选到与目的RNA结合的蛋白。
RNA/DNA pull down是研究体外条件下RNA或DNA与蛋白互作的重要技术。该技术通过体外转录目的RNA的一部分或全长，用生物素标记转录产物，再与链霉亲和素磁珠孵育使之固定在磁珠上，用以“pull down”互作蛋白，纯化的产物蛋白经特定抗体的western-blot实验，可验证某种蛋白与目的RNA/DNA是否有相互作用；纯化的蛋白经质谱鉴定，即可筛选到与目的RNA结合的蛋白。
实验原理
RNA Pull-down：通过体外转录RNA并用生物素进行标记，然后与胞浆蛋白混合物共同孵育形成RNA-蛋白质复合物，然后用链霉亲和素标记的磁珠分离纯化该复合物（利用生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用），洗脱后进行检测，如果检测蛋白为已知蛋白可通过WB进行鉴定，如果检测未知蛋白则可以结合质谱进行鉴定。流程为提取细胞胞浆蛋白样品液→体外转录合成生物素标记RNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。
DNA Pull-down：通过合成标记有生物素的DNA片段，与细胞核蛋白混合物共同孵育形成DNA-蛋白质复合物，然后用链霉亲和素磁珠纯化，WB或者质谱进行检测鉴定。流程为提取核蛋白样品液→合成生物素标记DNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。
DNA pull-down实验步骤
DNA pull-down实验步骤
DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记，跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合；纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，再经过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。
以下为参考实验流程，不同实验室会有细微差异：
探针设计及标记
1.采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
2.将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；
3.使用PCR法或末端标记法标记探针；
4.标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
5. -20℃保存，待用；
Pull down
1.预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
2.取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
3.将 DNA 与蛋白的混合物加到磁珠中，重悬磁珠；
4.4℃孵育 1 小时；
5.5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
6.用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
7.加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
蛋白质检测-- western blot
1.电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
2.转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
3.封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
4.孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
5.孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
6.显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
蛋白质检测-- MS
1.切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
2.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
3.脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
4.脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
5.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
6.脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
7.用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
8.质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
9.离子源加速电压1为24kv；
10.加速电压2为22kv；
11.离子延迟提取0.000ns；
12.真空度1.4×10-7 Torr；
13.质谱信号单次扫描累加200次；
14.使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
15.样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
16.利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
RNA pull-down实验步骤
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。
1.RNA pull-down实验技术流程
（1）目标RNA的制备及生物素标记。
目标RNA制备的一般流程包括：
构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证
体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板
体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA
（2）磁珠富集RNA
（3）RNA结合蛋白孵育
（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况
（5）WB或者MS检测
2.样品选择
样品类型：细胞或组织为主
样品量:
a）细胞：5×108
b）组织：500 mg
获取难易程度：细胞系扩大培养即可，推荐；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；
样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；
其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响；植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高存在影响。
以下为参考实验流程，不同实验室会有细微差异：
探针设计及标记
1.采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
2.将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；
3.使用PCR法或末端标记法标记探针；
4.标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
5. -20℃保存，待用；
Pull down
1.预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
2.取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
3.将 DNA 与蛋白的混合物加到磁珠中，重悬磁珠；
4.4℃孵育 1 小时；
5.5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
6.用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
7.加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
蛋白质检测-- western blot
1.电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
2.转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
3.封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
4.孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
5.孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
6.显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
蛋白质检测-- MS
1.切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
2.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
3.脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
4.脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
5.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
6.脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
7.用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
8.质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
9.离子源加速电压1为24kv；
10.加速电压2为22kv；
11.离子延迟提取0.000ns；
12.真空度1.4×10-7 Torr；
13.质谱信号单次扫描累加200次；
14.使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
15.样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
16.利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
RNA pull-down实验步骤
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。
1.RNA pull-down实验技术流程
（1）目标RNA的制备及生物素标记。
目标RNA制备的一般流程包括：
构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证
体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板
体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA
（2）磁珠富集RNA
（3）RNA结合蛋白孵育
（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况
（5）WB或者MS检测
2.样品选择
样品类型：细胞或组织为主
样品量:
a）细胞：5×108
b）组织：500 mg
获取难易程度：细胞系扩大培养即可，推荐；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；
样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；
其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响；植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高存在影响。
结果展示
RNA Pull-down
DNA Pull-down
实验周期及交付标准
1. 实验周期：1-2个月
2. 交付标准：
RNA Pull-down：探针序列、X光片、实验报告（实验步骤、试剂、仪器等）
DNA Pull-down：探针序列、X光片、实验报告（实验步骤、试剂、仪器等）
需确认信息
1. 目的基因种属及ID号
2. 基因序列信息
3. 样本种属及类型
4. 样本数量
5. 分析要求
参考文献
[1] Chen R , Liu Y , Zhuang H , et al. Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(17):9947-9959.
[2] Tran D H , Shishido Y , Chung S P , et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5'-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 116:94-100.
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[1] Chen R , Liu Y , Zhuang H , et al. Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(17):9947-9959.
[2] Tran D H , Shishido Y , Chung S P , et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5'-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 116:94-100.
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