- ￥2000
- RNA Pulldown、DNA Pull-down
- 全国
- 2026年01月08日
11 年钻石会员
企业认证
万千商家帮你免费找货
0 人在求购买到急需产品
- 详细信息
- 询价记录
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
晶莱生物
- 服务名称：
RNA Pulldown、DNA Pull-down
- 规格：
RNA Pulldown、DNA Pull-down
实验意义
核酸与蛋白质的互作是细胞功能的核心，包括蛋白质合成、mRNA组装等生命活动中重要的代谢过程，研究核酸与蛋白质的互作是研究生命科学的基本工具。
RNA/DNA pull down是研究体外条件下RNA或DNA与蛋白互作的重要技术。该技术通过体外转录目的RNA的一部分或全长，用生物素标记转录产物，再与链霉亲和素磁珠孵育使之固定在磁珠上，用以“pull down”互作蛋白，纯化的产物蛋白经特定抗体的western-blot实验，可验证某种蛋白与目的RNA/DNA是否有相互作用；纯化的蛋白经质谱鉴定，即可筛选到与目的RNA结合的蛋白。
RNA/DNA pull down是研究体外条件下RNA或DNA与蛋白互作的重要技术。该技术通过体外转录目的RNA的一部分或全长，用生物素标记转录产物，再与链霉亲和素磁珠孵育使之固定在磁珠上，用以“pull down”互作蛋白，纯化的产物蛋白经特定抗体的western-blot实验，可验证某种蛋白与目的RNA/DNA是否有相互作用；纯化的蛋白经质谱鉴定，即可筛选到与目的RNA结合的蛋白。
实验原理
RNA Pull-down：通过体外转录RNA并用生物素进行标记，然后与胞浆蛋白混合物共同孵育形成RNA-蛋白质复合物，然后用链霉亲和素标记的磁珠分离纯化该复合物（利用生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用），洗脱后进行检测，如果检测蛋白为已知蛋白可通过WB进行鉴定，如果检测未知蛋白则可以结合质谱进行鉴定。流程为提取细胞胞浆蛋白样品液→体外转录合成生物素标记RNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。
DNA Pull-down：通过合成标记有生物素的DNA片段，与细胞核蛋白混合物共同孵育形成DNA-蛋白质复合物，然后用链霉亲和素磁珠纯化，WB或者质谱进行检测鉴定。流程为提取核蛋白样品液→合成生物素标记DNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。
DNA pull-down实验步骤
DNA pull-down实验步骤
DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记，跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合；纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，再经过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。
以下为参考实验流程，不同实验室会有细微差异：
探针设计及标记
1.采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
2.将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；
3.使用PCR法或末端标记法标记探针；
4.标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
5. -20℃保存，待用；
Pull down
1.预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
2.取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
3.将 DNA 与蛋白的混合物加到磁珠中，重悬磁珠；
4.4℃孵育 1 小时；
5.5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
6.用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
7.加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
蛋白质检测-- western blot
1.电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
2.转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
3.封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
4.孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
5.孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
6.显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
蛋白质检测-- MS
1.切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
2.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
3.脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
4.脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
5.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
6.脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
7.用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
8.质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
9.离子源加速电压1为24kv；
10.加速电压2为22kv；
11.离子延迟提取0.000ns；
12.真空度1.4×10-7 Torr；
13.质谱信号单次扫描累加200次；
14.使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
15.样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
16.利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
RNA pull-down实验步骤
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。
1.RNA pull-down实验技术流程
（1）目标RNA的制备及生物素标记。
目标RNA制备的一般流程包括：
构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证
体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板
体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA
（2）磁珠富集RNA
（3）RNA结合蛋白孵育
（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况
（5）WB或者MS检测
2.样品选择
样品类型：细胞或组织为主
样品量:
a）细胞：5×108
b）组织：500 mg
获取难易程度：细胞系扩大培养即可，推荐；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；
样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；
其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响；植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高存在影响。
以下为参考实验流程，不同实验室会有细微差异：
探针设计及标记
1.采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
2.将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；
3.使用PCR法或末端标记法标记探针；
4.标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
5. -20℃保存，待用；
Pull down
1.预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
2.取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
3.将 DNA 与蛋白的混合物加到磁珠中，重悬磁珠；
4.4℃孵育 1 小时；
5.5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
6.用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
7.加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
蛋白质检测-- western blot
1.电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
2.转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
3.封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
4.孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
5.孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
6.显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
蛋白质检测-- MS
1.切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
2.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
3.脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
4.脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
5.清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
6.脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
7.用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
8.质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
9.离子源加速电压1为24kv；
10.加速电压2为22kv；
11.离子延迟提取0.000ns；
12.真空度1.4×10-7 Torr；
13.质谱信号单次扫描累加200次；
14.使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
15.样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
16.利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
RNA pull-down实验步骤
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。
1.RNA pull-down实验技术流程
（1）目标RNA的制备及生物素标记。
目标RNA制备的一般流程包括：
构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证
体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板
体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA
（2）磁珠富集RNA
（3）RNA结合蛋白孵育
（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况
（5）WB或者MS检测
2.样品选择
样品类型：细胞或组织为主
样品量:
a）细胞：5×108
b）组织：500 mg
获取难易程度：细胞系扩大培养即可，推荐；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；
样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；
其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响；植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高存在影响。
结果展示
RNA Pull-down
DNA Pull-down
实验周期及交付标准
1. 实验周期：1-2个月
2. 交付标准：
RNA Pull-down：探针序列、X光片、实验报告（实验步骤、试剂、仪器等）
DNA Pull-down：探针序列、X光片、实验报告（实验步骤、试剂、仪器等）
需确认信息
1. 目的基因种属及ID号
2. 基因序列信息
3. 样本种属及类型
4. 样本数量
5. 分析要求
参考文献
[1] Chen R , Liu Y , Zhuang H , et al. Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(17):9947-9959.
[2] Tran D H , Shishido Y , Chung S P , et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5'-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 116:94-100.
晶莱生物服务流程
收费标准/服务周期/提供结果：
欢迎咨询详谈，我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容，或来电咨询！
做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！
【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导等服务。
【北京公司】北京经济技术开发区科创十三街12号院德为科技园1号楼5层
【长沙公司】长沙市高新区麓谷大道627号新长海中心A1-1203室
【晶莱生物】已开展了数千个实验外包项目。我们专注于医学课题研究，已从课题申请、方案设计、试剂采购、模型构造、标本检测、数据分析，各个环节积累了数千个成功案例经验，为数千个来自临床的科研工作者解决了大量的科研问题。更多相关实验服务信息请咨询晶莱生物
晶莱生物服务流程
收费标准/服务周期/提供结果：
欢迎咨询详谈，我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容，或来电咨询！
做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！
【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导等服务。
【北京公司】北京经济技术开发区科创十三街12号院德为科技园1号楼5层
【长沙公司】长沙市高新区麓谷大道627号新长海中心A1-1203室
【晶莱生物】已开展了数千个实验外包项目。我们专注于医学课题研究，已从课题申请、方案设计、试剂采购、模型构造、标本检测、数据分析，各个环节积累了数千个成功案例经验，为数千个来自临床的科研工作者解决了大量的科研问题。更多相关实验服务信息请咨询晶莱生物
风险提示：丁香通仅作为第三方平台，为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全，合理判断，谨慎选购商品，商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品，请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
- 作者
- 内容
- 询问日期
文献和实验该产品被引用文献
[1] Chen R , Liu Y , Zhuang H , et al. Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(17):9947-9959.
[2] Tran D H , Shishido Y , Chung S P , et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5'-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 116:94-100.
相关实验
in the nucleus in human cell cultures we designed several RNA-biotin based pulldown assays which can be used alone or in combination with other known assays such as ChIP and Flag-tagged pulldown assays. Three protocols are explained
HNADOCK - 一个研究 RNA 与 DNA/RNA 互作的平台
核酸（RNA/DNA）之间的相互作用在许多基本的细胞活动中起着重要作用，例如转录调控，RNA 加工和蛋白质合成。因此，确定 RNA/DNA 之间的复杂结构对于理解相关核酸相互作用的分子机制至关重要。因为结构往往决定了分子的功能，这种核酸-核酸相互作用的结构建模和预测对于理解原子级相关生物过程的分子机制，进而开发针对相互作用的干预性治疗药物或措施也是至关重要的。因为采用实验技术来探究 RNA/DNA 之间相互作用通常是复杂困难且高成本的，因此从核酸序列计算并预测核酸复合体结构并进行分子模拟对接
• 以96孔板方式，从同一个细胞或组织样本中同时纯化基因组 DNA和总RNA • 处理 96 个样本，只需不到60 分钟 • 从同一样本中纯化高品质的基因组DNA和总RNA • 96孔板方式，高效的操作流程 • 高度标准化的操作流程 • 高重复性的DNA和RNA产量 Product description The AllPrep DNA/RNA 96 Kit is well suited for high
技术资料暂无技术资料 索取技术资料
文献支持
RNA Pulldown、DNA Pull-down
￥2000
