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- xuanya
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- XY-TE-0792
- 2025年11月21日
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- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体 T3 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有 T3 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 T3 启动子下游开始合成与模板 DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 T3 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的最佳长度在 20 nt 到 5000 nt 之问。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模板可以合成 2-6 ug RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。
通用型MLPA试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）
通用型MLPA试剂盒使用方法
一、制备 DNA 模板
PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T3 启动子。如果模板是 PCR 产物，则可以在设计引物时将 T3 启动子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 T3 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T3 启动子下游。三是需要转录的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如选择了 Pst I 来线性化质粒），则最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的DNA 模板是否有残留 RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分：
通用型MLPA试剂盒注：此为 20uL 反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要定做 NTP 分开而不是 NTP 预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（本公司有各种加帽修饰核苷酸）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 T3 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3 uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除 DNA 模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买， 本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase（ 3-5 U/uL）。
2. 37℃保温 15-30 分钟降解 DNA。
3. 补水到 100 uL（体积太小不方便下步的酚氯仿抽提）。
4. 用等体积（100uL）的 Tris 饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂（用前需要摇晃 混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃长期保存。
通用型MLPA试剂盒答客问
1、没有 RNA 产物。最常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模 板 DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor 用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。最常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的第一个和第二个碱 基最好都是 G，在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。 可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依 赖于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。 如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒 DNA 线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转 录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。 如果在转录体系中加入 GMP，则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得 RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA？需加入带帽 NTP 类似物即可，本公司提供 5 种供选择。
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文献和实验X，抑癌基因的失活。 7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。 MLPA的特点： 1.基于PCR的反应，一个反应同时检测多达50个基因组DNA序列的拷贝数。 2.样本量要求：只需20 ng 人DNA，羊水0.5 ml 约3000个细胞。 3.能区分一个碱基的差异的核酸序列。 4.反应条件优化，所有试剂盒基本适用同一反应条件，试剂盒包含了所有必需试剂。 5.高通量：24小时内得到结果。 6.仪器要求：只需普通PCR仪和测序仪。 7.检测范围：从点突变到大染色体缺失
，12,000 g离心2 min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心2 min。 【结果】 DNA Marker, DL5000 (TSJ012-100/500)；样品1-5：全血样本。 【数据来源】 青岛大学附属医院马老师 【来自老师的评语】 以前我们用过其他公司专门提取血液基因组的是试剂盒，血液用量比较大，效果也一般，胶图背景脏；擎科这款动物基因组提取试剂盒属于通用型的，可以一盒多用这点是非常不错的，而且提取的时候血液用量少，提取效果也能满足我后续的实验要求，挺
？ （1）对于罕见组织（如临床活检样本、胚胎组织、罕见病变组织等），这类稀有，微量，难获得的组织解离，在解离方案没有优化出来的情况下，建议选择类似的模式生物样本进行解离方案的优化，而不是直接用珍贵的罕见组织进行试验。 （2）可以选择通用型组织解离试剂盒，通过机械分离与酶消化相结合的方式，将组织分解成单细胞悬液，这种处理方式能够保持组织的结构完整性。其操作温和、快速且效果显著，能够解离后保持细胞活性。 （3）针对小鼠前列腺，小鼠耳部，发炎神经组织，大鼠肺部，成年小鼠/大鼠心脏等组织，结合通用的组织解离试剂盒，使用
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