BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+U

特别提示：包括BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(高含量ROX校正染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(高含量ROX校正染料)
英文名称：BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG)(High ROX)
产品货号：WE0156
产品规格：5ml

  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含 BaldStar Taq DNA polymerase、PCR Buffer、dNTPs(dTTP全部被dUTP所取代)、UNG酶和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列的检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等。本产品中运用了dUTP-UNG防污染系统，在PCR反应体系配制过程中加入了dUTP，因此就形成了含有dU碱基的扩增产物。而此产物可以在下次进行PCR反应前，由PCR体系中的UNG酶处理消除。这样就有效的去除了PCR产物的残留污染，大大降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性。UNG酶在PCR循环中的预变性步骤即可被灭活，因此不会影响新的含dU碱基PCR产物的形成。本品含有的 BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的 PCR缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，可以检测单拷贝的模板。使用本产品可以得到更广的线性范围，对目的基因定量更准确。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0154)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0155)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0156)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

组份	WE0154-5ml	WE0155-5ml	WE0156-5ml
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。


使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定zuì佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

两步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	1 min

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增。

三步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火	55℃-65℃	30s
延伸	72℃	30s

储存条件：-20℃，避免反复冻融

除了BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(高含量ROX校正染料),，我公司还供应以下相关产品：



名称：25mM氯化镁溶液(PCR级MgCl2溶液)
货号：BTN90302
规格：5mL
本产品为专门用于PCR的MgCl2，其浓度为25mM，可以用于调节MgCl2的zuì佳浓度。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

名称：可逆型Taq DNA聚合酶抑制剂
货号：BTN60901
规格：0.3mL
Taq DNA聚合酶是进行PCR的zuì常用工具酶，但是由于它在常温下还是具有部分活性，所以经常会出现非特异的扩增产物，尤其是当PCR反应体系中有大量非特异DNA存在的时候。目前zuì常见的解决方法是使用抗Taq DNA聚合酶的抗体和使用经过化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶(如AmpliTaq Gold)，但前者的缺点是加热后抗体会不可逆失活，后者的缺点是需要预热处理使酶激活。

产品特点：
1.可逆抑制Taq DNA聚合酶的活性，即常温抑制Taq酶活性，在45℃以上抑制功能丧失，当温度降低到45℃以下后，抑制活性又得以恢复。
2. 耐热，产品本身为非蛋白质试剂，远比Anti-Taq抗体稳定，便于保存和运输。
3. 使用简单，在加Taq酶前将本产品按PCR反应体积的1/10直接加入即可。
4.适用范围广，除Taq DNA聚合酶外，还可用于抑制其他DNA聚合酶的活性，如：Tth pol、Stoffel片段、Tfl pol、Tbr pol等。而一种酶的抗体一般对另一种酶的活性没有抑制作用。
5.与后续的RT-PCR兼容。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
在加入Taq或Tth DNA聚合酶之前，按PCR反应终体积1/10的比例将本产品加入到反应体系中混匀，然后再加入DNA聚合酶，启动PCR反应。

名称：10mM dNTP混合溶液
货号：ALH286
规格：1ml|5ml
本品是dATP、dGTP、dCTP、dTTP的等摩尔混合液，浓度均为10mM，PCR反应时,不用稀释可直接使用，PCR反应时的标准使用量为每50μl反应液使用1μl（终浓度200μM）

储存条件：-20℃。

本制品别名：10mM dNTPs

名称：10mM dNTP溶液
货号：RFT162
规格：0.5ml|5×0.5ml
本品为dATP、dGTP、dCTP、dTTP的等摩尔(10mM)混合物。dNTP纯度均达到99％以上，不含DNase和RNase，适合多种聚合酶的扩增反应。在PCR反应中，10mM dNTP是50μl反应体系用1μl(终浓度为各200μM)。

储存条件：-20℃。

名称：RNase抑制剂
货号：RFT107
规格：2000U|5×2000U
本RNase抑制剂是一种大肠杆菌表达的重组蛋白，可以通过非竞争性方式按1:1比例和RNase A、RNase B或RNase C结合，并抑制这三种酶的活性，保护RNA不被这三种酶降解。但本RNase Inhibitor不能抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。本品浓度为40U/μl

对于cDNA合成、体外转录、体外翻译等常见的反应体系中，为保护其中的RNA不被RNase降解，RNase Inhibitor推荐用量为zuì终浓度1-2U/μl。

特点：不含DNA内切酶和外切酶，用于各种RNA相关反应，防止RNase的污染。
用途：用于cDNA合成，体外转录，体外翻译，以及mRNA-protein复合物分离纯化等过程中保护RNA不被降解；还可用于特定RNase活性的鉴定等。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为人类胎盘中编码该酶的基因。
分子量：约49.6 kDa(单体)。
活性定义：将能够抑制5ng RNase A的50% 活性的酶量定义为一个活性单位。
活性检测条件：100mMTris-HCl (pH7.5)，1.2mMEDTA，0.1mg/ml BSA，100ng/ml RNase A，0.1mg/ml E.coli [3H]-RNA，50mg/ml yeast RNA，8mMDTT。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
储存溶液：20mM HEPES-NaOH (pH7.5)，50mM NaCl，8mM DTT，0.5mM Detergent，50% (v/v) glycerol。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

名称：SYBR Green I(PCR级，10000X)
货号：QN0947
规格：50μl|100μl|1ml
SYBR Green I 染料是一种直接与双链 DNA (dsDNA) 结合的荧光染料，是荧光定量PCR zuì常用的DNA结合染料。在定量 PCR中，SYBR Green I可与双链DNA(dsDNA)非特异性结合后发出荧光，则可以通过检测反应体系中的SYBR Green I 荧光强度，达到检测PCR 产物扩增量的目的。游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，一旦与dsDNA结合，其荧光增加1000倍，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA量成比例，且会随扩增产物的增加而增加;所以通过检测PCR 反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的熔解温度。

使用说明：
使用时，配置PCR反应混合液，将10000×SYBR Green I浓缩液加入到PCR反应体系，使终浓度为0.5× (0.2×到1×之间调整)。以上操作建议在冰上进行。
注：
① 反应液配制方法和PCR 扩增条件请参照DNA聚合酶使用说明。
② Realtime PCR 扩增仪的使用方法，请参照各仪器说明书。

注意事项：
使用浓度对荧光PCR结果的影响
SYBR Green I的使用浓度是保证荧光定量PCR实验成功非常关键的因素。如果SYBR Green I的浓度过低会使荧光信号的变化降低，这就意味着低拷贝的样品可能无法检出;而在高浓度时，将会抑制PCR反应，降低PCR反应效率。所以一般在使用SYBR Green I时应根据实际情况优化使用浓度，反应的终浓度为0.2×到1×之间。

镁离子浓度的影响
提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应高出0.5～3mM。

储存条件：-20℃避光，有效期至少一年。

名称：高特异性热启动Taq DNA聚合酶
货号：MT0026
规格：250U|2500U
本品为化学修饰的热启动Taq DNA 聚合酶，独特的封闭技术使得该酶在50℃以下100%无活性，仅通过95℃加热15分钟后才能完全恢复活性，从而启动PCR扩增，提高PCR扩增的特异性，降低引物二聚体、非特异性条带的扩增、提高特异性PCR产物的产量。该热启动Taq酶具有5"-3"外切酶活性，可用作TaqMan探针的定量PCR。同时该酶扩增的PCR产物具有“A”尾巴，可直接用于TA克隆。以λDNA为模板，可以很好的扩增10 Kb的DNA片段；以人类基因组DNA为模板,可以很好的扩增4 Kb的DNA片段。本品常用于PCR扩增、TaqMan探针的定量PCR、DNA测序等。

产品特点：
1．化学法修饰热启动酶，100%热启动；
2．高特异性，有效抑制非特异性扩增；
3．无外源性核酸污染，纯度高达99.9%。

产品组成：

组分	250U	2500U
Top HotStart Taq DNA Polymerase(5 U/μl)	50μl	500μl
*10×Top HotStart PCR Buffer	1ml	5ml

*10×Top HotStart PCR Buffer含25mM Mg2+，通常不再需要额外添加Mg2+即可获得良好的扩增结果。

保存条件：-20℃保存，有效期2年。

单位定义：一个活力单位即在在74℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。

反应实例：

图：应用不同公司的热启动Taq DNA 聚合酶扩增鸡PPAR基因片段（522bp，72％GC含量）。
M: DNA Marker 2000；
泳道1-2: Top HotStart Taq；
泳道3-4: T公司抗体封闭法 HotStart Taq；
泳道5-6:普通Taq酶。