Green qPCR MasterMix（Low ROX）

存储条件：-20℃避光保存。如需频繁使用，可存放于2-8℃，避免反复冻融
制品说明：
  Green qPCR MasterMix（Low ROX）是专用于染料法（SYBR GreenI）实时荧光定量PCR的预混体系，包含HotStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和一管Low ROX校正染料，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测。本品所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。
本品含有的HotStar Taq DNA Polymerase是一种全新高效、经抗体修饰的热启动酶，在常温下无聚合酶活性，有效避免了常温条件下由引物和模板非特异性结合而造成的非特异产物的产生，酶的激活只需在95℃下孵育2分钟。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，有效抑制非特异性的PCR扩增，显著提高PCR的扩增效率。　
所含的ROX染料可校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，本试剂盒中ROX校正染料含量较低，适用于ABI Prism7500/7500 Fast，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等需要较低ROX信号校正的荧光定量PCR仪。
产品特点：
1.本产品中使用了全新高效热启动酶HotStar Taq DNA Polymerase与独特的PCR缓冲体系，显著提高PCR的扩增效率，具有灵敏度高和特异性强的特点；
2.适用于荧光定量 PCR 检测，能够准确地对目的基因进行定量分析和检测。
注意事项：
1.使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用；
2.本产品中含有 SYBR Green I 荧光染料和ROX 染料，保存本产品或配制PCR 反应液时应避免强光照射；
3.避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。
4.本品不能用于探针法荧光定量 PCR。
5.配制反应液时，请使用新的或者无污染的枪头和离心管，尽量防止污染。

货号	产品名称	规格
XG-P2846	Green qPCR MasterMix（Low ROX） 低ROX校正qPCR荧光定量Mix-染料法	1 ml
XG-P2846	Green qPCR MasterMix（Low ROX） 低ROX校正qPCR荧光定量Mix-染料法	1ml×5
XG-P2846	Green qPCR MasterMix（Low ROX） 低ROX校正qPCR荧光定量Mix-染料法	1ml×15

 

 PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
Green qPCR MasterMix（Low ROX） 低ROX校正qPCR荧光定量Mix-染料法保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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