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- xuanya
- 中国/美国
- XY-TE-0734
- 2025年11月06日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
常温运输和保存
- 保质期：
两年
- 英文名：
Instant Fluorescent PCR Kit
- 库存：
950
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析（quantitativePCR、qPCR）。本产品含有经过优化的缓冲液组分、优化的TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBRGreenI和稳定剂等成分。本产品中优化的TaqDNAPolymerase高温加热前，抗Taq单克隆抗体与Taq结合，抑制Taq聚合酶活性，从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板DNA之间的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增。而且抗体在PCR反应的预变性步骤中能完全失活，不会阻碍之后TaqDNA聚合酶的活性，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。
1.方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量PCR实验。
2.使用抗Taq抗体封闭的优化的TaqDNA聚合酶，可抑制低温条件下的非特异性扩增。
3.使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制PCR反应。
4.快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
5.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为50拷贝/mL的靶分子。
ROX参考染料运输及保存：
低温运输，-20℃保存,保存期限为6个月。
自备试剂：DNA模板、引物、超纯水。
ROX参考染料使用方法
1.以20uL的qPCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分:
ROX参考染料放入荧光PCR仪中进行扩增,并在退火或延长步骤中记录荧光信号。
注意：
a)通常引物浓度以0.2μM可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考；通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ngcDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
b)ROX校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI7700和7900，ROX的最佳浓度为1×（即在每20uL反应体系中加2uL10×ROX）。对ABI7500，ROX的最佳浓度为0.05-0.1×（每20uL反应体系加0.1-0.2uL10×ROX；也可将10×ROX稀释到1×，然后每个反应体系加入1-2uL1×ROX）。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“PassiveReferenceDye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。对于iCyclerIQ，MJOpticon，MJChromo4，MX3000，MX4000,RotorGene3000，RotorGene6000和LightCycler480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
2.循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。
ROX参考染料A：两步快速循环法：适用于引物Tm值设计为60℃的反应
注意：本产品所采用的酶在预变性95℃、2-5min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可适当提高退火温度。
B：三步快速循环法：
适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR（长引物PCR）
ROX参考染料注意：退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度：延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于AT含量大于70%的扩增子来说，延伸温度设为60℃为宜。
C：通用循环法：
这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。
3.按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。
ROX参考染料注意事项
1.如果使用iCycler，可以不加入FAM。
2.如果使用RocheLightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。
ROX参考染料相关产品：
| Pifithrin-a(p53 抑制剂 ) |
| PMA/TPA (PKC 激活剂 ) |
| Pyrrolidinedithioca rbamin acid.ammonium salt(NF-kB 抑制剂 / 抗氧化剂 ) |
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| SB203580(p38MAPK 抑制剂 ) |
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| S-Methyl-ITU.sulfate(iN0S 抑制剂 ) |
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| SNP(NO 供体 ) |
| ROX参考染料SOD( 抗氧化酶 ) |
| Sodium Butyrate(HDAC 抑制剂 ) |
| Sodium orthovanadate( 磷酸酯酶抑制剂 ) |
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| Staurosporine(PKC 抑制剂 ) |
| Superoxide dismutase( 抗氧化酶 ) |
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| Tocopherol( 抗氧化剂 ) |
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| Trichostatin A(HDAC 抑制剂 ) |
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| Wortmannin(PI3K 抑制剂 ) |
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| 细胞分离液 |
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| 大鼠淋巴细胞分离液 1.083 |
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| 大鼠中性粒细胞分离液 1.091 |
| 大鼠粒细胞分离液 1.119 |
| 人肿瘤细胞分离液 1.055 |
| 人胰岛细胞分离液 1.056 |
| ROX参考染料人内皮细胞分离液 1.060 |
| 人 NK 细胞分离液 1.062 |
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文献和实验扩增曲线的分析攻略。 1、确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有 ROX 来作为参比荧光染料。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器可以用 ROX 来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。目前市面上有的的荧光定量 PCR 预混液是不含有 ROX 的，当用此类试剂的时候，应该将 ROX 参比
%，避免引物内含有互补序列，3』端尽量不要出现含有连续三个以上的 G 或 C 的片段，真核基因设计引物时最好跨内含子哦。 选择合适 ROX 参照染料 各位同学在选购产品、做实验时，首先要弄清自己实验室的仪器对应哪种 ROX（High 还是 Low）！试剂买回来，样也加好了，最后发现不能用在自家仪器上，内心也一定是很崩溃。诺唯赞的染料法荧光定量专用预混液提供各种 ROX 供选择，如果不想这么麻烦，ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix （Q711）那是极好
时发现，这个实验其实是有扩增的，但原本应该平直的 ROX 荧光曲线却呈现出一个跟 SYBR 颠倒对称的图形（图 12B）。我们查看 Raw data 时发现其第一通道荧光（FAM）是正常上升的，第四通道荧光（ROX）也是维持在正常水平，这就怀疑可能与校准文件异常有关。这台仪器在重新做了 SYBR 荧光校准以后，扩增曲线就恢复正常了，也能得到正常的 CT 值。 图 12 校准文件异常导致曲线异常 关于扩增曲线异常的更多案例分析可以参考我们之前的推文《荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略
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