pTG-T载体快速克隆试剂盒（不含MCS)

特别提示：包括pTG-T载体快速克隆试剂盒（不含MCS)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：pTG-T载体快速克隆试剂盒（不含MCS)
英文名称：pTG-Simple-T-vector Fast Cloning Kit
产品货号：WH0195
产品规格：20μl|60μl

本试剂盒中的Fast pTG-Simple-T载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，经由克隆质粒在XcmI内切酶酶切后得到的带3´T突出末端的线性化载体，通过该方法产生的带有3´T突出末端的线性化载体效率远高于传统酶切加尾法。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3´端添加一个A，可与Fast pTG-Simple T-Vector 3´端的T互补连接。此外，Simple T-Vector突变掉多克隆位点，以方便自行引入酶切位点。

试剂盒中配备了新型的Rapid Ligation Mix（目录号：WH0193）为高效的T4 DNA连接酶反应试剂，其中含有连接增强剂、酶稳定剂，可大大缩短连接时间、提高PCR产物的连接和克隆效率。按不同需要配备了DH5感受态细胞以及对照用超螺旋质粒，方便进行转化。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入（白色克隆为阳性重组克隆，蓝色的为载体自连的克隆，具体筛选原理参考分子克隆等书籍）。克隆后，可使用通用引物T7、SP6进行鉴定和测序。

产品特点：
·高效快速：5min快速连接，阳性率近100%。
·灵敏广泛：适合低至0.025pmol浓度片段和长至8 kb片段的高效连接。
·无多克隆位点：载体自身无多克隆位点，方便自行引入酶切位点。

试剂盒组成：

组分	WH0195-1	WH0195-2
Fast pTG-Simple T-Vector	20μl	60μl
Rapid Ligation Mix（2×)	100μl	100μl×3
Control Insert DNA（688bp)（50ng/μl)	10μl	10μl
DH5α（100μl each)	100μl×10	100μl×30
Compcell Control Plasmid pUC19（0.1ng/μl)	10μl	10μl
ddH2O	1ml	1ml

保存条件：感受态细胞需要严格的在-70℃冻存，保质期6个月，其余的试剂可于-20℃保存1年，避免反复冻融。（载体和连接试剂可以适当的分装成小份，防止反复冻融，以保证质量）。

不同片段使用量：
载体与片段的摩尔比控制在1:3～1:10，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度和片段长度来计算其摩尔比。插入片段用量，可根据以下公式粗略计算：
插入片段用量ng=（3～10)×（插入片段长度/载体长度
)×载体用量ng
连接体系中50ng的载体，不同大小的PCR产物zuì佳加入量举例如下：

PCR产物长度	zuì佳的使用量
700bp	35ng
2000bp	100ng

反应体系：标准体系为10μl体积，5μl的反应体系也能取得很好的效果，试剂用量减半。

Fast pTG-Simple T-Vector载体图谱：



注意事项：
1．连接使用的PCR片段3"端应带有A末端，如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的平末端片段，可选用零背景快速克隆试剂盒（WH0191/WH0192）或Fast pTG-T平末端连接试剂盒（WH0213）进行连接反应。
2.转化过程中使用Control Insert DNA做对照是非常必要的，在实验出现问题时可以确定原因。
3.建议留下部分连接产物，在出现问题后能迅速的补救，减少不必要的重复实验。
4.涂布用量可根据具体实验作相应调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2 min）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。

使用方法：（以下的步骤请在无菌条件下操作)
1．按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分。

成分	使用量
Rapid Ligation Mix（2×）	5 μl
Fast pTG-simple T-Vector（50ng/μl)	1 μl
目的PCR片段/Control Insert DNA	X μl/1 μl
ddH2O	补足至10μl

2．轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂离心3-5sec。将混合反应液置于室温（22℃）反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
  注意1：如果插入片段长度小于1kb，反应时间可以采用5min。
  注意2：如果插入片段长度为1～2kb，反应时间可以采用5～10min。
  注意3：如果插入片段长度为2～3kb，反应时间可以采用10～20min;更长片段可采用30min至过夜。
3．转化
①制备含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，至少预热20min。
②取部分连接产物加到50-100 μl DH5α感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30 min（必要时请使用超螺旋质粒pUC19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将1 μl的Compcell Control Plasmid pUC19加入另一只感受态细胞管中作为对照，其余的操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。
③将离心管置于42℃水浴90 sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，期间不要摇动离心管。
④向离心管中加入350 μl 37℃预热的SOC或LB（不含抗生素）培养基，180 rpm、37℃振荡培养45-60 min。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
⑤将离心管中的菌液混匀，吸取200μl加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒或玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16h。
4．检测
①常规检测：将得到的白色菌落接种1-5ml LB（含有终浓度为50-100μg/ml的氨苄青霉素）培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
②快速检测：挑取白色菌落直接进行PCR检测或使用本公司重组菌落PCR鉴定试剂盒（WH0198）进行快速菌液鉴定。
③测序鉴定：使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。

除了pTG-T载体快速克隆试剂盒（不含MCS),，我公司还供应以下相关产品：



名称：即用型蓝白T载体C型(T7-T3，无MCS)
货号：BTN120513
规格：20次
本产品是用Xcm I酶切线性化的DNA片段，其两个末端的5′都有一个突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。

产品特点：
1. 由于是通过酶切制备，所以载体两端的带T率为100%，远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上，缩短了筛选过程。
3. 无Nde I和Nco I等多克隆位点，便于重组基因的克隆
4. 来源于pBlueSoript Ⅱsk(+)，故克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
5.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
7.含有丝状噬菌体f1复制起始子，可以制备单链DNA。

产品组成：

组分	规格
即用型蓝白T载体C型(10ng/μL)	60μl
阳性对照(35ng/μl)	30μl

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

质粒图谱


名称：GRE荧光素酶报告基因质粒(糖皮质激素响应元件)
货号：YT448
规格：1μg
GRE报告基因质粒是用于检测糖皮质激素响应元件(glucocorticoid response element, GRE)转录激活水平的报告基因质粒。GRE质粒是以pGL6质粒为模板，在其多克隆位点插入了多个GRE位点，可以高灵敏度地检测GRE的激活水平，检测糖皮质激素介导的信号途径(glucocorticoid-mediated signaling pathway)的激活水平。

pGL6质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫萤光素酶报告基因检测的新一代质粒。该报告基因质粒比Promega公司的pGL3系列有了全面的改进，一方面对于luciferase的编码进行了改进，确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达，同时对整个质粒中所有可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理，在保持原有功能不变的情况下，使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到zuì低。

GRE质粒的主要信息如下：
 

Base pairs	5615
Glucocorticoid response element (GRE)	26-70
luc2 reporter gene	116-1768
SV40 late poly(A) signal	1803-2024
SV40 early enhancer/promoter	2072-2490
Synthetic neomycin phosphotransferase
(Neor) coding region	2515-3309
Synthetic poly(A) signal	3334-3382
Reporter Vector primer 4 (RVprimer4) binding region	3449-3468
ColE1-derived plasmid replication origin	3706
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region	4497-5357
Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site	5462-5615
Reporter Vector primer 3 (RVprimer3) binding region	5564-5583

GRE质粒的图谱如下：


使用说明：
1. 首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2. GRE可以用常规的细胞转染方法转染细胞。检测时可以采用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(YT271)或双萤光素酶报告基因检测试剂盒（YT273）。
3. 糖皮质激素可以激活GRE，可以用作GRE报告基因检测时的阳性对照。

储存条件：-20℃。