心肌成纤维细胞培养（威斯腾生物-中关村生物医学研发检测共享平

一、实验介绍 ：
胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。体外培养的成纤维细胞多为梭形、多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达。它具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类型之一

二、实验步骤：
用Langendorff灌流消化（胶原酶II）只能取得心肌细胞。建议直接将心脏剪碎，成纤维细胞我们这里一般采用0.05％胰酶消化。无菌条件取出心脏D-hank's液（PBS也可）漂洗，剪碎心脏加入5倍体积消化液，37C水浴3－5min，反复吹打，静置，待自然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及0.1%胶原酶II混合液，反复吹打，大约10分钟（消化时间往往靠经验的判断），离心取沉淀重悬于含20％BSA的DMEM（有条件可以用Cascade的培养液）。60－90min后更换培养液（差速贴壁，成纤维细胞比心肌细胞贴壁快）。
1、胰酶的作用比较强烈，联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀，提高细胞存活率。另外，消化时间不宜太长，主要凭观察和经验来判断。离心采用1000rpm 5min。
2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理盐水都行。血清的作用主要是终止消化，用一般加了血清的DMEM就行，我们这里是20％胎牛血清。
3、贴壁时间：2hr。
4、细胞可以先用台盼蓝测定存活率。
5、鉴定：在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核大，呈椭圆形，常含有2－3 个核。IHC可以用I抗体（动物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌动蛋白）其余基本按IHC的步骤来。 实验服务流程

威斯腾生物服务项目

分子生物学类	蛋白质与免疫学	动物实验
实时荧光定量PCR	单克隆抗体制备	帕金森疾病模型
免疫共沉淀（Co-IP）	多克隆抗体制备	抑郁症动物模型
ELISA（酶联免疫吸附法）技术	Western-blot 实验服务	脊髓损伤模型
生化指标检测	蛋白双向电泳实验服务	脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测	原核蛋白表达纯化	骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀（ChIP）	真核蛋白表达纯化	心肌缺血模型
GST pull Down	ITRAQ定量蛋白质组学	心力衰竭模型
	SLAC蛋白组学	肺动脉高血压动物模型
		高血压模型
病毒类	实验课题整体外包	粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化	整体课题外包	大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化	细胞整体实验外包	慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化	动物整体实验外包	过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化		肺炎大鼠模型
		肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片	原代细胞培养	肝纤维化模型
细胞因子芯片	骨髓间充质干细胞培养	胆结石模型
生长因子芯片	脂肪干细胞培养	急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片	心肌成纤维细胞培养	急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片	软骨细胞培养	体内血栓模型
生长因子芯片	血管内皮细胞培养	关节炎模型
炎症因子芯片	神经元细胞培养	I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片	内皮组细胞原代培养	裸鼠成瘤
凋亡因子芯片		基因编辑动物
趋化因子芯片	电生理相关服务	动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片	膜片钳实验
细胞生物学	高通量测序	代谢组学
细胞原代培养	mRNA测序	气相色谱GC/MS
MTT检测	LncRNA测序	液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测	全基因组测序	核磁共震NMR
细胞周期检测	RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验	外显子测序	影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭	16s扩增子测序	Micro-CT
流式分选	Small RNA测序	小动物活体成像
CCK8/XTT检测	宏基因组测序	核磁共振
台盼蓝检测细胞活性	单细胞测序	PET-CT
药物筛选细胞学实验	circleRNA测序
细胞粘附性检测	甲基化测序	基因编辑动物
细胞划痕实验		条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验		全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理类	CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入	基因芯片
扫描电镜	基因定点突变细胞系	LncRNA芯片
透射电镜	单基因敲除细胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除细胞系	mRNA芯片
免疫组化	目的基因敲入细胞系	甲基化芯片（限人和小鼠来源样本）
Tunel（原位末端凋亡法）检测	报告基因敲入细胞系	SNP芯片（限人和小鼠来源样本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色	CRISPR/Cas9动物敲除/敲入	科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交	基因敲除大鼠/小鼠	科研文献论著翻译
荧光原位杂交	基因敲入大鼠/小鼠	SCI论文翻译润色服务
特殊染色（PSA、茜素红、阿尔新蓝等）		临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测	药物筛选服务项目	药效学评价
水迷宫实验	高通量自动药物筛选平台	神经系统药物药效学评价
旷场实验	细胞高内涵药物筛选平台	抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测	蛋白质组学靶标研发平台	心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测	分子药理研究平台	泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳	生物膜片钳药物筛选平台	内分泌系统药物药效学评价
	常规药物体外筛选	抗炎免疫药物药效学评价

【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！