心肌细胞培养

一、实验介绍
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中，我中心拥有专业的细胞培养技术平台，为客户提供心肌培养技术服务。

二、实验步骤
小鼠心肌细胞培养过程：
1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。
3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。
4．把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。
5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。
6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。
7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，垫小锁，打开关。
8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。
9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。
10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。
11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。
12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）

三、无菌操作的注意事项：
细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯杀菌1h，操作前用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上口罩和帽子，操作时不能大声说话，双手戴上一次性橡胶手套，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

四、威斯腾生物服务流程


五、威斯腾生物服务项目

【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！