深层组织的高分辨率·高亮度分析 SeeDB2

深层组织的高分辨率·高亮度分析

SeeDB2

SeeDB2 Trial Kit是用于SeeDB2法的透明化试剂盒，通过调整Permeabilization solution、Clearing Solution等各种试剂，可实现透明化。该方法由柯孟岑老师、今井猛博士等人开发，通过制备试剂盒内的溶液并浸泡脑组织块，即可实现透明化。特别适用于通过荧光蛋白标记样本的3D高分辨率成像。

该方法保留了脑组织的微结构，由于调节为高折射率（RI=1.52），适用于高分辨率成像，也可应用于迄今为止难以进行的树突棘定量分析。

对照SeeDB2G的甘油折射率（1.46）和SeeDB2S的油折射率（1.52），分别用甘油浸没镜头和油浸镜头观察，可见即使在深层部分也没有因为球面像差而引起模糊（分辨率降低）。

此外值得注意的是在SeeDB2中，荧光蛋白的荧光保持非常稳定，并且优于PBS和其他市售的封固剂。因此，SeeDB2十分适合作为荧光蛋白标记样本的封固剂。它不仅可用于厚样本，还可用于细胞生物学的薄样本和组织切片。

数据提供：国立研究開発法人理化学研究所柯孟岑先生、今井猛先生（现九州大学医学研究院）

本试剂盒内容：1）皂素、2）SeeDB2G solution、3）SeeDB2S solution、4）PBS

 

◆SeeDB2特点

● 可在保留微结构的同时完成透明化

● 调整为高折射率，可观察深层结构

● 稳定维持来自荧光蛋白的荧光^※

※Alexa等染料会出现褪色

 

经实例验证可透明化处理的样本

小鼠脑组织块、苍蝇全脑、类器官/球状体

 

SeeDB2 Trial Kit试剂盒构成

1. SeeDB2G Solution 50 mL x 1支

2. SeeDB2S Solution 50 mL x 1支

3. PBS（-）50 mL x 1支

4. Saponin 5 g x 1支

 

SeeDB2S：与油浸物镜浸液的折射率（1.52）相匹配，可用作油浸镜头观察时的封片剂。 用于高分辨率成像。

SeeDB2G：与甘油浸物镜浸液的折射率（1.46）相匹配，可用作甘油浸镜头观察时的封片剂。 用于观察较大的组织样本。

 

透明化所需试剂或器材（具体请参考附件）

试剂

1. SeeDB2 Trial Kit

2. 多聚-甲醛（产品编号：160-16061）

3. 1×PBS（产品编号：164-25511）

4. 透镜浸液

 

器材

1. 环形镊子或画笔

2. 试管旋转器

3.  无菌过滤器

4. 振动切片机

5. 透明化样品观察容器（透明室）

6. 玻璃载玻片和盖玻片（如使用透明室则不需要）

7.  用于SeeDB2透明化样本的荧光显微镜^※和推荐物镜^※※

※ 共焦显微镜、双光子显微镜、超分辨率显微镜

※※ 请使用与折射率（RI=1.46或1.52）相匹配的物镜。 建议在获取数据前向显微镜制造商咨询。

 

◆Protocol示例

小鼠脑0.5-2mm切片

● Permeabilization Solution：含2% saponin的PBS溶液

● Clearing Solution 1：含20％ saponin的水溶液和SeeDB2G以2:1比例混合的溶液

● Clearing Solution 2：含20% saponin的水溶液和SeeDB2G以1:1比例混合的溶液

● Clearing Solution３：含2% saponin的SeeDB2G

● Clearing Solution 4：含2% saponin的SeeDB2S

 

图1. 小鼠脑SeeDB透明化案例

小鼠脑切片（1.5mm厚）的SeeDB2处理前后

 

◆应用示例

● 共聚焦显微镜观察实例

● 超分辨率显微镜观察实例

● 神经细胞的多色荧光成像

 

使用共聚焦显微镜观察小鼠脑切片的实例

图2. 使用共聚焦显微镜观察Thy1-YFP H系小鼠脑切片

使用NA 1.4油浸物镜。即使不调整激光功率，从上到下得到的亮度也几乎恒定。比例尺为2 µm

 

超分辨率显微镜观察实例

在超分辨显微镜下观察使用 SeeDB2S/Super Clear Mount（产品编号：190-18661）进行了透明化和封片处理的样品（图3、4）

 

图3. 丝状伪足在细胞膜上的生长

使用核染色试剂和线粒体染色试剂对在细胞膜上表达EGFP的HEK293T细胞进行染色和观察。 通过超分辨率数据可观察到丝状伪足在细胞膜上的生长（图3）。

 

图4. 果蝇大脑深部的超分辨率成像（深度约100 μm）

使用GFP标记Mi1（果蝇脑髓质神经节中的一个神经细胞）并进行超分辨率观察（图4）。

 

神经细胞的多色荧光成像

 

图5. 使用Tetbow法进行神经细胞的多色荧光成像

使用Tetbow法^※ 标记小鼠嗅球二尖瓣细胞和簇状细胞的数据。比例尺为20 μm。

※ Tetbow法：使用不同颜色对单个神经细胞进行高亮度染色。

 

点击此处查看组织透明化配套耗材：成像用透明室

点击此处查看相关产品宣传册：组织透明化试剂（第3版）

 

 

组织透明化试剂Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：组织透明化的原则

Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配

 

Q：组织透明化的优势

Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。

 

Q：透明化技术的比较

Ａ：下面是水性的透明化技术。

SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化DiI(细胞膜红色荧光探针，一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB有着一定优势。另外SeeDB会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。SeeDB2是为使用高NA物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY或者CUBIC会是更好的选择。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您应该根据您的物镜的WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过3mm。对于十分薄且脆弱的样品，我们建议使用琼脂糖包埋。使用CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重复性。

 

Q：样品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的荧光信号。

 

Q：抗体的荧光标记

Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。

 

Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：适用于CUBIC的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：适用于SeeDB2的显微镜

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）

 

Q：重构

Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。

 

Q：物镜推荐

 

Q：其他物种？其他器官？

Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。

Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

 

透明化方法相关

Q1. 透明化过程中样品是否会膨润？

A1. 使用SeeDB2法在透明化过程中不会引起样品膨润，因此适用于样品微结构的保留及观察。

 

Q2. 进行透明化后的的样品应如何存储？

A2. SeeDB2G样品请冷藏避光存储。需在SeeDB2G中长期存储时，可添加0.05 (w/v)% 叠氮化Na。SeeDB2S样品请室温避光存储。SeeDB2S中已添加叠氮化Na，无需再另外添加。

 

 

透明化观察相关

Q1. 荧光蛋白信号能持续多长时间？

A1. 可观察6个月以上。

 

Q2. 是否可以进行荧光染料染色或抗体染色？

A2. 可以，但需要在透明化处理前进行。还需要注意Alexa等染料容易褪色。方法详情请参考DOI: 10.21769/BioProtoc.3046。

 

Q3. 推荐使用哪种观察容器？

A3. 可使用直径略大于组织样本的培养皿或与样本厚度相匹配的See Through Chamber（透明室）。

 

Q4. 推荐使用什么显微镜？

A4. 请使用共聚焦显微镜、双光子显微镜或超分辨率显微镜。此外，请使用与 SeeDB2G（RI=1.46）或 SeeDB2S（RI=1.52）折射率相匹配的物镜。详情可参考Evident公司生产的物镜列表，也可咨询您正在使用的显微镜的制造商。

 

Q5. SeeDB2G和SeeDB2S推荐使用什么浸液？

A5. 推荐将使用SeeDB2G（RI：1.46）封片的样品浸入甘油中，使用甘油浸没物镜进行观察；推荐将使用SeeDB2S（RI：1.52）封片的样品浸入油中，使用油浸物镜进行观察。