双荧光素酶报告基因 检测启动子活性

1. 技术简介

双荧光素酶报告基因系统是一种高度灵敏且定量的体外实验技术，用于直接检测并量化一段DNA序列是否具有启动子活性，以及对其活性强度进行评估。其核心设计基于一个巧妙的“替换”与“校正”逻辑：

1. 启动子驱动报告基因：将待测的DNA序列（候选启动子）克隆至一个本身无启动子的报告基因（最常用萤火虫荧光素酶）的上游。如果该序列具有启动子功能，它就能启动下游报告基因的转录和翻译，从而产生可检测的荧光素酶信号。信号强弱直接反映了该启动子的活性强度。

2. 内参校正消除误差：为了排除转染效率、细胞数量、细胞活力和测量条件等非特异性因素对结果的干扰，该系统引入了第二个报告基因（最常用海肾荧光素酶），并由一个组成型活性启动子（如SV40、CMV）驱动。该内参报告基因的表达水平在不同样品间应是恒定的，作为内对照。

通过计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，即可得到一个标准化后的相对启动子活性，从而实现对不同启动子片段活性进行精确、可靠的比较。

2. 实验步骤

1. 报告载体构建

   • 将待测的启动子序列克隆至萤火虫荧光素酶报告基因的上游（例如，插入pGL3-Basic或pGL4系列载体的多克隆位点）。这些基础载体自身不含有任何启动子/enhancer，确保本底活性极低。

   • 作为阳性对照，可使用由强组成型启动子（如SV40、CMV）驱动的荧光素酶载体（如pGL3-Control）。

   • 作为阴性对照，即使用未插入启动子的空pGL3-Basic载体。

2. 细胞转染

   • 选择与研究背景相关的细胞系或者使用模式细胞如HEK-293T细胞。

   • 将构建好的报告载体与内参载体（表达海肾荧光素酶的质粒，如pRL-TK、pRL-SV40）共转染入细胞。

3. 孵育与裂解

   • 转染后培养24-48小时，让细胞有足够时间进行基因表达和蛋白质合成。

   • 收集细胞并使用专用的被动裂解液裂解细胞。

4. 荧光检测与数据分析

   • 使用双荧光素酶检测试剂盒，在化学发光检测仪上依次测量每个样品的荧光素酶活性。两种酶的底物和反应条件不同，可在同一管中顺序检测。

   • 先测萤火虫荧光素酶活性：加入萤火虫荧光素酶底物，测量光信号（反映待测启动子活性）。

   • 再淬灭并测海肾荧光素酶活性：加入淬灭/海肾底物，淬灭上一个反应并同时启动海肾荧光素酶反应，测量光信号（作为内参）。

   • 数据处理：

     • 计算每个样品的 萤火虫荧光素酶活性 / 海肾荧光素酶活性 的比值。

     • 将实验组（含待测启动子）的比值与阴性对照组（空载体）的比值进行比较，通常将后者设为1，从而计算出待测启动子的相对活性倍数。

结果判定：

• 若待测启动子组的标准化活性显著高于阴性对照组，则证明该序列具有启动子活性。

• 活性越高，表明该启动子的转录起始能力越强。

3. 技术应用

• 验证启动子及其核心区域：鉴定一段推测的DNA序列是否确实具备启动子功能，并通过对序列进行5‘或3’端截短，定位其最小核心区域。

• 比较不同启动子活性强度：将不同基因的启动子或同一基因的不同变异体（如单核苷酸多态性SNP）克隆至报告载体，比较它们的相对活性强弱。

• 研究顺式作用元件：通过定点突变、缺失等方法，鉴定启动子内特定的转录因子结合位点或其他调控元件的功能。

• 评估外界刺激对启动子的影响：研究药物、激素、细胞因子或应激等处理如何影响特定启动子的活性。

4. 技术优势

• 高灵敏度与宽线性范围：荧光检测极其灵敏，动态范围可达7-8个数量级，能检测到微弱活性并进行精确定量。

• 定量准确，重复性好：内置的参照系统最大限度地减少了实验误差，结果可靠度高。

• 灵活性高：可自由研究任何克隆进载体的DNA序列，不受内源基因背景干扰。

• 操作相对便捷：商业化试剂盒和载体非常成熟，流程标准化。