对虾白斑病毒(WSSV)单重荧光PCR检测试剂盒

对虾白斑病毒(WSSV)单重荧光PCR检测试剂盒
本试剂盒适合于检测对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品等样本中的对虾白斑病毒(WSSV)，用于对虾白斑病毒(WSSV)感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。

本试剂盒用一对对虾白斑病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对对虾白斑病毒DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染动物的病原学诊断。

对虾白斑病毒(WSSV)单重荧光PCR检测试剂盒组成：

组份	数量	规格
WSSV反应液(WSSV-qPCR MIX)	1管	672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX)	1管	48μL/管
阴性对照(NTC)	1管	50μL/管
WSSV阳性对照(WSSV-PTC)	1管	50μL/管

对虾白斑病毒(WSSV)单重荧光PCR检测试剂盒储存条件：-20℃，有效期6个月。

使用方法：

一、样品采集及前处理：
对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品0.1g左右，其中，对虾幼体、仔虾取完整个体，3cm以下的幼虾取摘除虾眼的头胸部，较大的幼虾可取腮区或数根腮丝，成虾取1-2根腮丝或自心脏或腹部血窦抽取血淋巴，怀疑为慢性感染的较大幼虾或成虾取淋巴器官。如果2h以后才能处理，宜将样本保存于无水乙醇中。非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品，取0.1-0.5g。

手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)，并按照相应试剂盒说明进行操作。
对上述处理好的样本加入等体积核酸提取液(固体标本加入50μL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存； 
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、对虾白斑病毒(WSSV)单重荧光PCR检测试剂盒检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(WSSV-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	14μL	N×14μL
酶混合液	1μL	N×1μL
总量	15μL	N×15μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(WSSV-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。 
2．qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10 min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
?阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(WSSV-PTC)：均产生扩增曲线。
?以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
?在试验成立的条件下，Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线，表明WSSV核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明WSSV核酸阴性。
?如果Ct值＞35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行WSSV 检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明WSSV核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。