猫呼吸道病原体五联检荧光定量PCR试剂盒

编号	组分	25次-体积	50次-体积
A	猫呼吸道五联引物混合液A	100μl×1管（棕色管）	200μl×1管（棕色管）
B	猫呼吸道五联引物混合液B	100μl×1管（棕色管）	200μl×1管（棕色管）
C	qPCR扩增反应液	800μl×1管（绿盖）	800μl×2管（绿盖）
D	猫呼吸道五联阳性对照	150μl×1 管（黄盖）	300μl×1 管（黄盖）
E	猫呼吸道五联阴性对照	150μl×1 管（白盖）	300μl×1 管（白盖）
F	使用说明书	1 份	1 份

注：猫呼吸道五联引物混合液A包含FCV、FHV和内参FC；猫呼吸道五联引物混合液B包含CF、MF、Bb。

【储存条件及有效期】

低温运输、-20℃±5℃避光保存、反复冻融少于 5 次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI系列、Bio-Rad系列、Roche LightCycler R480、杭州博日系列等多通道荧光PCR仪。

【样本要求】

1.样品取鼻拭子、口腔溃疡面拭子，采集方法如下：

(1)鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入2-4 ml采样液中，尾部弃去。

(2)口腔溃疡面拭子：用棉签擦拭舌、硬腭、腭中裂周围，同样将棉签头浸入2-4 ml采样液中，尾部弃去。

【检验方法】

1. 样品处理（样本处理区）

我们建议使用商品化的试剂盒提取DNA/RNA，严格按照对应试剂盒说明书操作，样本核酸提取过程种应避免污染。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满10份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

A孔位配制组分	反应体积
猫呼吸道五联引物混合液A	4μl
qPCR扩增反应液	16μl
总体积	20μl

 

B孔位配制组分	反应体积
猫呼吸道五联引物混合液B	4μl
qPCR扩增反应液	16μl
总体积	20μl

 

将步骤1提取的 DNA/RNA、阳性对照、阴性对照各取5μl，分别加入相应A和B管及其他管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。每个反应管中反应体积为25μl。

4. PCR 扩增

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，VIC/HEX，ROX，Cy5， 淬灭通道NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

推荐循环参数设置：

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。

5. 结果分析判定：

1.试剂盒有效性判定：

（1）样本核酸FC（内参）Ct值≤35，若Ct值＞35则为采样或者提取过程出现问题，需重新采样并复测。

（2）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

根据下表中5种病原体对应荧光通道检测结果判断：

孔位	FAM对应靶标	HEX对应靶标	Cy5对应靶标	ROX对应靶标
A	猫杯状病毒（FCV）	猫疱疹病毒（FHV）	——	内参FC
B	猫支原体（MF）	猫衣原体（CF）	猫支气管败血波氏杆菌（Bb）	——

（1）阳性：扩增曲线呈S型，且检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；

（2）可疑：扩增曲线呈S型，且检测通道 35.08，建议重复检测，如果检测通道仍为 35.08，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。