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- 康朗生物
- KL-A080
- 国产/进口
- 2025年07月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
86
- 英文名：
肠出血性大肠杆菌(O157)单重荧光PCR检测试剂盒
- 保质期：
-18℃以下，有效期6个月
- 供应商：
上海康朗生物科技有限公司
- 保存条件：
-18℃以下，有效期6个月
- 规格：
48次/盒
本试剂盒适用于增菌培养物、疑似病料及食品中大肠杆菌O157的检测，其检测结果仅供参考。
出血性大肠杆菌(EHEC O157)可引起人的出血性腹泻和肠炎的大肠埃希氏菌，引发人类、家畜以及野生禽兽不同形式的疾病。本方法为荧光PCR检测方法，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中或预培养液中的大肠杆菌O157进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。O157的探针报告基团为FAM，淬灭基团为None。
试剂盒组成：
| 组份 | 数量 | 规格 |
| 大肠杆菌O157荧光qPCR反应液(O157-qPCR MIX) | 1管 | 720μL/管 |
| DNA抽提液(DNA Extraction) | 2管 | 1.5mL/管 |
| 阴性对照(NTC) | 1管 | 50μL/管 |
| 阳性对照(O157-PTC) | 1管 | 50μL/管 |
肠出血性大肠杆菌(O157)单重荧光PCR检测试剂盒储存条件：-20℃以下，有效期6个月。
使用方法：
一、样品采集：
?食品样品：样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验 (GB/T 4789.36-2008) 要求进行。
?粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
?液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
?固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
?粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
?其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注：建议采用相关标准方法进行前增菌，并按照液体培养物方法进行提取。阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
三、肠出血性大肠杆菌(O157)单重荧光PCR检测试剂盒检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qPCR反应液(O157-qPCR MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
| 荧光PCR反应液 | 15μL | N×15μL |
向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(O157-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：
| 1循环 | 50℃ for 2 min | |
| 预变性 | 1循环 | 95℃ for 10 min |
| PCR扩增 | 40循环 | 95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。
四、肠出血性大肠杆菌(O157)单重荧光PCR检测试剂盒结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
?阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(O157-PTC)：均产生扩增曲线。
?以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
?在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明O157核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明O157核酸阴性。
?如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行O157 qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明O157核酸阳性；否则判为样本阴性。
五、注意事项：
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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大肠埃希菌的简介： 大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝固酶。根据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为产肠毒素性大肠埃希菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠集聚性黏附性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌5种。部分埃希菌菌株与婴儿腹泻有关，并可引起成人腹泻或食物中毒的暴发。肠出血性大肠埃希菌O157
大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝固酶。根据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为产肠毒素性大肠埃希菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠集聚性黏附性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌5种。医学教育|网搜集整理部分埃希菌菌株与婴儿腹泻有关，并可引起成人腹泻或食物中毒的暴发。肠出血性大肠埃希菌O157：H7
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