AAV-U6gRNA1-U6gRNA2-TnT-Cre同源重

过表达都是相似的，敲除的方法却很多

和RecBCD蛋白组成，在基因敲除时必须以环状质粒存在）、结合转化敲除系统及温度敏感型质粒敲除系统等可供选择。   2 FLP-FRT系统和Cre-loxP系统 这两个系统都是位点特异性重组酶系统，其中FLP-FRT源于酿酒酵母，Cre-loxP源于F1噬菌体。两个系统的基本原理类似。以Cre-loxP系统为例，该系统含有两种成分：第一个部分是一段长34 bp的重组酶识别的DNA序列（loxP），其中含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列；第二个是Cre

CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导

的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行基因操作，在 PAM (5'-NGG) 上游～3bp 进行切割，如下图所示。因此本实验的关键步骤是设计一对 20bp（不包括 NGG 在内的）完全互补的 oligo 插入到如上图所示的 filler。另 U6 启动子需要 5' 端的 G 起始转录，因此若设计的 oligo 第一个碱基非 G，需额外增加一个 G。操作详细流程1. 设计 sgRNA关于 sgRNA 的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握

病毒载体在基因治疗中的应用怎么分工？慢病毒、AAV、腺病毒一表看懂（含代表管线）

当 TU/mL 用，剂量能差几个数量级，做剂量换算前一定先看单位。 为什么这一点值得单独说 临床管线里“用哪种病毒”取决于治疗路径。 ex vivo细胞改造常看慢病毒，in vivo体内递送常看AAV，腺病毒在疫苗和溶瘤领域更常见。载体分工背后是机制与应用场景，而不是品牌偏好。 慢病毒：细胞治疗的主力递送工具 CAR-T 的做法是把患者 T 细胞取出来，用载体把嵌合抗原受体基因导进去，扩增后回输。T 细胞属于典型的难转染细胞，质粒和普通试剂效率低，所以慢病毒（或 γ-逆转录病毒）几乎是默认选择，尤其