抗体 WB 制胶 ECL 试剂

WB 为何又翻车？

最近师妹开始做 WB 实验了，但是一天又一天重复做，却次次结果不理想。除了没有拿到组会可以汇报的条带外，师妹集齐了所有奇奇怪怪的条带：微笑带，皱眉带，拖尾带，甚至没有条带…… 师妹也因此对我发出了灵魂拷问：「为什么 WB 实验这么容易翻车？」 虽然 WB 是一类基础实验，但是基础并不代表简单。翻车的主要原因在于 WB 的步骤实在繁琐：从配置蛋白胶开始，到蛋白电泳、蛋白转膜、抗体孵育，一整套流程下来花费 1～2 天的时间才能进行最后的显影。这些环节中但凡有一个出错，就会导致实验

WB 实验背景很脏是什么原因？该如何解决？

过夜具体多长时间算合适，其实没有硬性规定；   二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育 1~2 小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。   6、发光液配置   大部分实验室使用的 ECL 发光液，A 液和 B 液按照 1：1 的比例配置；   发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量；   发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。

WB方法

蛋白，样本稍微放长些时间就悲催了 其次，western blot的过程是有标准化的，但是蛋白上样的量跟你抗体，发光体系的选择也是有一定关系的，我做过一个36KD左右的蛋白在ECL发光时在一样的一抗浓度下，ECL发光用到50ug也就跟奥德赛双色显色系统用20ug一样的效果。你可以尝试从1.0板 15孔 20ug（这应该是最省样本的了吧？）先做起，看内参情况调节上样量，把内参砸漂亮了就差不多了，总之，每个实验都不一定非得要上20ug，我个人的体会。不足之处，不要扔砖头啊 毛毛