人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒

人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒

仅用于科学研究

产品信息
产品名称：人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒
货号：FY200008
批号：见包装
存储与有效期：

组分A、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的预混液于2-8 ℃保存，有效期1个月，完全培养基现配现用，2-8 ℃保存不超过72 小时。
适用细胞：
人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。
产品介绍
间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，在再生医学和组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、胶原含量检测、免疫组化检测等。
本产品仅适用于科学研究。
操作方法
实验准备
u 试剂配制：
预混液：室温融化添加物B和添加物C，将融化后加入A液，充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。
注意：添加物解冻后旋涡混匀、1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后，吸取A液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入A液中。预混液必须充分混匀，2-8 ℃保存。
诱导完全培养基：取10 ml预混液置于15 ml离心管中，加入一支添加物D，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1 ml预混液需加入添加物D的量为10 μl。
注意：诱导完全培养基现配现用，2-8 ℃放置不得超过72小时。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
u 自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  MSC完全培养基
l  4%中性多聚jiaquan溶液
注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤
1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
2.      220 g离心5 分钟，沉淀以预混液重悬，细胞密度约2×10⁶ cells/ml，再次离心，弃上清。
3.      沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为2×10⁶ cells/ml。
4.      分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中，220 g离心5 分钟。
注意：每管细胞的总数在5×10⁵至1×10⁶之间，一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为佳，细胞数过少形成的软骨团块较小，细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可形成1-2 mm³的团块。离心以细胞聚团为准，可适当调整。离心力过大，软骨球不易悬浮，离心力过小则可能形成软骨球效果不佳。
5.      旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养。
注意：24 小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
6.      诱导培养24 小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。
注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48 小时之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固，可用移液器轻轻吹动使其悬浮，注意不要吹散团块。
7.      每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸去旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。
注意：换液时动作轻柔，以免吸出细胞团块；诱导完全培养基必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。
8.      诱导培养14-20天，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚jiaquan溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。一般软骨球诱导致密后能进行染色处理，时间在14-20天左右，时间过久可能导致团块内部出现空泡，甚至团块裂开，具体时间请以自己细胞的特性自行确定。
9.      弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。
注意：脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。
10.  阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30 分钟，流水冲洗5 分钟，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。
注意：染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染，不建议复染。
11.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。
注意：该鉴定方法和判定标准为定性实验标准，可根据具体情况设置其他判定方法和标准。以上提供的是包埋切片染色的方案，若实验室条件限制，可选择直接对团块进行染色，方法见B9、B10、B11。若试剂盒用于组织工程软骨诱导，可作为除支架材料以外的诱导液使用。
B9.  弃去固定液，DPBS洗团块2次。
B10.              阿利新蓝染色：向团块中加500 μl阿利新蓝染液染色30 分钟。弃染色液，加纯水5 ml摇动清洗5分钟/次，反复洗5次。
注意：染色液中的团块不易看清，务必小心吸去上清，避免样本丢失。
B11.              结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见深蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。

文献引用：
Zhao ZH, Ma XL, Zhao B, Tian P, Ma JX, Kang JY, Zhang Y, Guo Y, Sun L. Naringin-inlaid silk fibroin/hydroxyapatite scaffold enhances human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-based bone regeneration. Cell Prolif. 2021 Jul;54(7):e13043. doi: 10.1111/cpr.13043. Epub 2021 May 19. PMID: 34008897; PMCID: PMC8249788.

吕云,王立生.诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性[J].中国实验血液学杂志,2019,27(04):1253-1258.
张娇;邹翠云;张蓓;江福能;钟惟德;朱建国. 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法[P]. 中国专利:CN201910267989.5,2019-04-03

弗元生物推出间充质干细胞鉴定相关产品系列，为间充质干细胞研究提供优质的产品与服务。

 

产品特点：
小包装，采用100 ml装，使用更节约、更方便；
简约装，升级产品、组成更简洁、操作更方便；
更稳定，产品系统误差更小，使用更稳定。

适用细胞类型：人源间充质干细胞，组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。

产品适用效果图：

1、成骨诱导，诱导第7天可见明显钙沉积出现、诱导10-14天基本达到足量的钙结节；
2、成脂诱导，诱导3天便可见小脂肪滴出现，诱导7-12天可完成鉴定，满足拍照需求；
3、成软骨诱导，按照说明书操作，方法简单，可进行切片染色和直接染色鉴定，建议使用切片染色。

特别提示：
该系列试剂盒适用于人间充质干细胞分化能力鉴定，提供染色试剂。若选用其他指标鉴定，如钙含量、脂肪含量、基因表达量等，则需要自备相关试剂。
该系列产品是鉴定使用，若细胞不符合要求，则形成率可能会低、甚至不会出现预期结果。
 

弗元生物，致力于打造具有国际影响力的生物医学品牌。

弗元生物立足于生物科技蓬勃发展的上海，与张江药谷、中科院、三甲医院等生物医学领域的各企事业单位协作紧密，共同为中国生物医学研究贡献力量。公司以干细胞与再生医学研究为核心，业务经营范围辐射到细胞生物学、分子生物学、免疫学等生物医学领域的多个相关学科。

至2019年初，公司有技术服务事业部、再生医学事业部和生命科学事业部三个主要发展部门。目前，在国际期刊杂志发表论文7篇，中文核心期刊发表论文1篇，申请国家发明专利4项，拥有商标9项；生命科学事业部，已经上市科研产品十余项，在研产品数十项；再生医学事业部，具有在研项目多项，包括间充质干细胞治疗缺氧性脑病、再生医学软骨、再生医学骨等，生物人工肝；技术服务事业部，服务了多家企业和科研机构，在再生医学的基础和转化研究上进一步完善了服务体系。