人肾类器官分化试剂盒 培养基

货号	产品名称	目录价（元）
RC200134	人肾类器官分化试剂盒	5625

 

产品信息
产品名称：人肾类器官分化试剂盒
货号：RC200134
批号：见包装
试剂清单：

序号	名称	数量	货号	存储
1	S1完全培养基	50 ml ×1	RC200134-1	-20至-80   ℃
2	S2完全培养基	50 ml ×1	RC200134-2	-20至-80 ℃
3	S3完全培养基	50 ml ×1	RC200134-3	-20至-80   ℃
4	S4完全培养基	100 ml ×2	RC200134-4	-20至-80 ℃
5	基础培养基	500 ml ×1	RC200134-5	2-8 ℃

存储与有效期：
组分1、2、3、4于-20至-80 ℃避光保存，必须避免反复冻融；首次完全解冻后可以按使用量进行分装，置于-20至-80 ℃长期保存；2-8 ℃条件下，稳定储存2周。组分5于2-8℃避光保存，有效期1年。
适用范围：
本试剂盒适用于人多能干细胞（胚胎干细胞、诱导多能干细胞）定向肾系细胞分化，同时进行立体培养，形成血管化肾类器官。
产品介绍
类器官与悬浮培养是当前再生医学研究与应用的前沿，是未来再生医学与组织工程发展的趋势。为适应日益发展的科研需求，并为生命科学尤其是再生医学研究的需要，开发优化了相关产品，可以为科研工作者提供稳定的研究平台，以助力研究的时效性和经济性。该产品设计同时考虑再生医学临床前研究的需求，可以为研究人员提供大量稳定的种子细胞，加速应用后期技术的研发。
本产品无血清、成分明确、含有细胞保护因子，适合于人多能干细胞向肾类器官的诱导，血管标志物KDR在该肾类器官部分细胞中表达阳性，说明该肾类器官能获得部分血管化。
操作方法
实验准备

1. 完全培养基准备：

组分1-4（S1、S2、S3、S4）均为完全培养基：2-8℃解冻。完全融化后轻轻摇匀，可以按照实际使用量分装。分装后立即存储于-20至-80 ℃，避免反复冻融。
注意：2-8℃冰箱过夜，切不可置于37℃水浴剧烈解冻，解冻后请务必充分混匀，以保证培养基成分的均匀度。冷冻组分解冻时会有絮状沉淀或结晶，每次使用前混合均匀使用即可，不影响使用效果。

1. 自备试剂耗材：

1. 多能干细胞完全培养基（推荐使用mTesR1培养系统）
2. 多能干细胞消化液（Accutase等）
3. 基质胶
4. 贴壁细胞培养板
5. 低吸附细胞培养板
6. Rock抑制剂（Y27632）
7. 细胞固定液（2-4%中性多聚jia醛）

操作方法

1. S1阶段：人多能干细胞生长至约60%汇合开始血管化的肾类器官诱导分化，要求人多能干细胞克隆形态良好。用基础培养基（RC200134-5）每孔2-3 ml洗细胞2次，加入S1完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续4天。该阶段为原条诱导阶段（primitive streak）。有部分细胞死亡为正常现象。

注意：本操作方案以六孔板为例，若使用其他器皿可以根据需要自行调整方案。调整方案时建议以细胞密度为稳定因素。细胞培养箱条件为37℃、5% CO₂、饱和湿度。所有培养基在使用前必须进行室温复温。这些注意事项同样适用于以下步骤。
注意：起始的多能干细胞（ES、iPSC）对后续诱导成功非常关键，请务必保证诱导时多能干细胞生长状态良好，50-60%汇合（参考诱导形态示例图）。该阶段诱导过程中有部分细胞死亡为正常现象。

1. S2阶段：诱导第5天，用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入S2完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续3天。该阶段为肾中胚层特化阶段（kidney mesodermal specialization）。

注意：移液枪吹打细胞时务必轻柔，切不可产生大量气泡，本试剂盒全程均需注意此问题。

1. S3阶段：诱导第8天，用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入S3完全培养基每孔2 ml，每天换液，连续4天。该阶段为肾祖细胞阶段（nephronic progenitor cells）。
2. S4阶段：诱导第12天，用DPBS每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次，加入适量（每孔1 ml）消化液Accutase（Gibco，货号A1110501），同时加入终浓度为10 µM的Rock抑制剂（Y27632）以提高细胞存活率。细胞消化约3-6分钟，待细胞易吹下即加入适量（每孔1-2 ml）S4完全培养基终止消化。收集细胞悬液到离心管中，800 转/分离心5分钟，弃上清；用适量S4完全培养基重悬细胞，同时加入终浓度为10 µM的Rock抑制剂（Y27632）。细胞接种于低黏附的培养器皿，6孔板一个孔消化的细胞接种于1个低黏附6孔板的一个孔，S4完全培养基加入量为每孔2-3 ml，每天用S4完全培养基每孔2-3 ml换液（不需添加Rock抑制剂）。培养过程中可通过低速离心的方式去除死细胞。若细胞团块过大，可以用枪头轻柔吹打至均一大小，继续培养至第24-26天。该阶段为相对成熟的阶段（maturation of kidney cells）。

注意：低速离心的方法为，收集细胞悬液，置于离心管中，建议200转/分，离心3-5分钟，弃上清。死细胞不会沉底，弃上清即可去除死细胞。细胞沉淀用完全培养基重悬，继续培养。
注意：S4阶段诱导过夜后细胞便会聚团成球（参考诱导形态示例图），若此时成球不明显，则后续成功的可能性很小，请注意根据形态示例图判断。
注意：继续培养过程中，若细胞团数量过多，可适当分到其他孔中继续培养。

1. 推荐检测：第0天、5天、12天及24-26天的各阶段标志物。第0天检测多能干细胞标志物，如OCT4、SOX2等；第5天检测原条阶段的标志物，如T/Brachyury、MIXL1等；第12天检测肾相关标志物，如SIX2、SALL1、NPHS1等，此阶段起可检测血管标志物KDR等；第24天检测相对成熟肾标志物，如JAG1、CDH1、LTL、AQP1、NPHS1、CD31、KDR等。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板，也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；细胞的初始状态对分化的成功至关重要，请务必保证初始细胞的可靠性。该试剂盒仅用于定型内胚层细胞向肾类器官分化的研究，用于其他研究时该操作规程仅作为参考。
诱导过程示意图：

诱导形态示例图：

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