人间充质干细胞成骨诱导试剂盒培

产品特点：
小包装，采用100 ml装，使用更节约、更方便；
简约装，升级产品、组成更简洁、操作更方便；
更稳定，产品系统误差更小，使用更稳定。

适用细胞类型：人源间充质干细胞，组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。

产品信息
产品名称：人间充质干细胞成骨诱导试剂盒
货号：FY200006
批号：见包装
存储与有效期：

组分A、C、D于2-8 ℃避光保存，组分B于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期1个月。
适用细胞：
人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。
产品介绍
间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，在再生医学和组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、钙沉积量检测、免疫组化检测等。
本产品仅适用于科学研究。
操作方法
实验准备
u 试剂配制：
室温融化添加物B液，将融化的溶液加入基础培养基A液中，充分混匀。
注意：混合成诱导完全培养基后必须充分混匀，2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
u 培养皿处理：
加适量包被溶液C液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液 ，室温晾干。
注意：包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板，每孔加C液1 ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。
u 自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  MSC完全培养基
l  4%中性多聚jia醛溶液
注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤
1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。
2.      按照2×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，可根据实验室情况进行调整，调整依据参照所检测MSC正常传代的密度接种，过夜培养后添加诱导培养完全培养基；或接种密度低，待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。
3.      当细胞融合达60%时，弃去培养上清，每孔添加MSC成骨诱导完全培养基2 ml/孔，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意：成骨诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，切记避免吹起细胞。
4.      每3天更换新鲜的MSC成骨诱导完全培养基，持续培养2-4周。
注意：细胞状态良好一般5天后培养液出现浑浊，不可与污染混淆，换液时尽量轻柔；7-10天左右出现钙沉积。一般2周内出现较大的较厚的钙沉积，透光性变差。有些细胞钙沉积出现较晚，一般不超过3周，超过3周未出现明显沉积，请注意分析操作步骤与其他原因。可根据具体实验需求选择终止时间，但不易超过4周。具体时间请根据自己实验室细胞等条件自行确定。
5.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚jia醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。
注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自行确定。
6.      弃去固定液，DPBS洗2次，加入茜素红染液1 ml/孔染色15分钟。
7.      弃去茜素红染液，DPBS洗3次，添加新鲜DPBS。
注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。
8.      显微镜下观察并拍照。
注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。
9.      结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见红色着色点，此处为钙结节，说明实验所用的MSC具有成骨能力。否则，所使用的MSC无成骨能力。

文献引用：

Zhao ZH, Ma XL, Zhao B, Tian P, Ma JX, Kang JY, Zhang Y, Guo Y, Sun L. Naringin-inlaid silk fibroin/hydroxyapatite scaffold enhances human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-based bone regeneration. Cell Prolif. 2021 Jul;54(7):e13043. doi: 10.1111/cpr.13043. Epub 2021 May 19. PMID: 34008897; PMCID: PMC8249788.

Xu Y, Jiang Y, Wang Y, Ren Y, Zhao Z, Wang T, Li T. LINC00473 regulated apoptosis, proliferation and migration but could not reverse cell cycle arrest of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by a high-dosage of dexamethasone. Stem Cell Res. 2020 Oct;48:101954. doi: 10.1016/j.scr.2020.101954. Epub 2020 Aug 11. PMID: 32829248.

吕云,王立生.诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的生物学特性[J].中国实验血液学杂志,2019,27(04):1253-1258.
张娇;邹翠云;张蓓;江福能;钟惟德;朱建国. 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法[P]. 中国专利:CN201910267989.5,2019-04-03

产品适用效果图：

1、成骨诱导，诱导第7天可见明显钙沉积出现、诱导10-14天基本达到足量的钙结节；
2、成脂诱导，诱导3天便可见小脂肪滴出现，诱导7-12天可完成鉴定，满足拍照需求；
3、成软骨诱导，按照说明书操作，方法简单，可进行切片染色和直接染色鉴定，建议使用切片染色。

特别提示：
该系列试剂盒适用于人间充质干细胞分化能力鉴定，提供染色试剂。若选用其他指标鉴定，如钙含量、脂肪含量、基因表达量等，则需要自备相关试剂。
该系列产品是鉴定使用，若细胞不符合要求，则形成率可能会低、甚至不会出现预期结果。
 

弗元生物推出间充质干细胞鉴定相关产品系列，为间充质干细胞研究提供优质的产品与服务。

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