检测步骤
1、 2µg/ml的Calf thymus DNA standard浓缩液的配制
用1×TE对Calf thymus DNA standard (100µg/ml)进行50倍稀释,即向30µl Calf thymus DNA standard加入1.47ml 1×TE混匀即可。
2、 标准曲线的制备
① 比色皿体系检测---(2ml)
a、按照表1 向一次性微量比色皿中加入TE和2µg/ml Calf thymus DNA standard,随后加入1ml PicoGreen定量试剂,混匀后,于室温避光孵育2-5min,并以1×TE缓冲液为blank。
【注】:确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。
TE (µl)
2µg/ml Calf thymus DNA standard (µl)
稀释的PicoGreen定量试剂(µl)
Calf thymus DNA standard终浓度
0
1000
1000
1µg/ml
900
100
1000
100ng/ml
990
10
1000
10ng/ml
999
1
1000
1ng/ml
1000
0
1000
blank
表1 比色皿体系所需加入各组分量及标准品终浓度表
b、于荧光仪中检测各浓度荧光值,Ex/Em=480nm/520nm。
【注】:为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内,应调节增益使含zuì高DNA浓度的样品荧光值与荧光仪的zuì大值一致;为了减少光漂白,应保持所有样品的检测时间一致。
c、各浓度得到的荧光值减去空白对照荧光值,对DNA浓度和荧光值做标准曲线。
② 微孔板体系检测(200µl)
a、按照表2 向96孔板中加入TE和2µg/ml Calf thymus DNA standard,随后加入100µl PicoGreen定量试剂,混匀后,于室温避光孵育2-5min,并以1×TE缓冲液为blank。【注】:确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。