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外泌体方案
外泌体（Exosome）
一、外泌体简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。
Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，Exosome可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。Exosome在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用，不同细胞来源的exosome所含有的RNA和蛋白成分不尽相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
miRNA是一类22nt左右大小的非编码分子， 它可以通过外泌体从一个地方转运到另外一个地方行使基因沉默功能。通过检测外泌体中miRNA表达变化，可以发现外泌体中miRNA特异性功能。
二、研究现状
1、外泌体研究的主要应用
外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，从而导致大量新生血管的生成，促进了肿瘤的生长与侵袭。
肿瘤
- 肿瘤转移。来自白血病干细胞的外泌体促进急性骨髓性白血病（AML）细胞的增殖、迁移和抑制细胞凋亡。
- 治疗靶标。利用外泌体递送小干扰RNA来沉默KRAS G12D，从而特异性高效靶向至胰腺癌细胞，以显著降低RAS活化、癌细胞增殖和转移过程。
免疫
- β细胞将含有蛋白质和miRNA的外泌体释放到细胞外，并可转移到其他代谢器官或免疫内皮细胞，有利于维持葡萄糖体内平衡或造成胰岛素抵抗。
心血管
- 外泌体介导miR-155从平滑肌细胞转移到内皮细胞导致了内皮细胞的损伤促进动脉粥样硬化
分子标记
- 疾病诊断。在酒精性肝病、NASH、病毒性肝炎、药物性肝损伤和肝细胞癌中发现循环EVs的水平上升。
- 预后标志。
2、2017年国自然基金热点分析以及外泌体课题申请情况
2017年国自然中共有249项外泌体的资助，其中111项是和肿瘤细胞的逃逸、耐药、转移等有关，102项和miRNA、lncRNA主题相关，众所周知外泌体中非编码RNA的比例中，miRNA为最多70%，其余的是lncRNA和circRNA等。
三、外泌体服务内容及服务流程
1、服务内容
1）外泌体提取服务。
超速离心、过滤离心、试剂盒提取等。
2）外泌体电镜检测鉴定。
大小（30-200nm）、形态也呈现出多样性，有研究分为9个类别依次为：单囊泡、双囊泡、 多膜泡、小双层膜泡、椭圆膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不规则膜泡，其中在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征：表面具涂层的膜泡、内含纤维的膜泡、电子致密囊泡。
3）纳米颗粒数检测。
通过Nanosight 可视型纳米颗粒分析仪确定外泌体颗粒数。
4）WB鉴定蛋白标志物。
蛋白包括CD63，CD81，CD9，HSP70，TSG101等。
5）外泌体基因、蛋白检测分析服务
- 外泌体高通量测序分析；
- 外泌体microRNA检测分析；
- 外泌体lncRNA检测分析；
- 外泌体蛋白表达检测分析。
3、外泌体整体研究方案实例：外周血中外泌体在肿瘤诊疗中的作用研究
背景介绍：外泌体是一种细胞外的纳米级囊泡，可以运送RNA，在细胞间传递物质信息，影响肿瘤的进展，外泌体的内容物（miRNA, lncRNA, circRNA）作为肿瘤诊疗标志物的研究已成为研究的热门领域。
技术路线：
1）客户提供早期、中期、晚期肿瘤病人外周血；
2）提取血清/血浆外泌体；
3）外泌体二代测序（miRNA, lncRNA, circRNA, mRNA）或基因芯片检测；
4）临床大样本量验证差异基因；
5）外泌体功能检测。
- 小室共培养研究外泌体功能；
- 影响细胞功能研究（增殖、凋亡、迁移、侵袭等）；
- 机制研究（miRNA靶基因验证、功能蛋白、信号通路、lncRNA等）；
6）动物研究。
关键词：外泌体提取、二代测序或基因芯片检测、功能检测
周期：1-12个月
用于分离外泌体样本类型及所需量：
血清样本：3-5ml
血浆样本：3-5ml
无血清培养细胞上清：50-100ml
体液：15-20 ml
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和元生物
什么是外泌体？ 外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。 脑组织分离方法简述：将脑组织剪成薄片，放入离心管中加上消化液进行消化，经水浴、反复轻轻上下颠倒，再用移液
proteins are visualized in the pellet fraction （P） after centrifugation of the reaction. 由于膜蛋白的过表达可能对细胞有毒性，并且在纯化时很难选择合适的溶解试剂，再加上目前对膜蛋白晶体培养缺少有效方法和模型，所以要想顺利地获得膜蛋白的三维数据更是难上加难。幸亏技术总在进步，创新的产品也不断涌现。QIAGEN在2009年推出了膜蛋白的整体解决方案
