RIP实验

RIP实验（RNA结合蛋白免疫沉淀）

一、技术简介

   RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列可通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

 

二、实验流程

 

1.细胞裂解液的制备

2.磁珠与抗体的准备

3.RNA结合蛋白免疫沉淀

4.用蛋白酶ķ对RNA-蛋白复合物进行消化

5.RNA纯化

6.对结合在复合物上的RNA反转录，合成cDNA

7.Q-PCR验证RNA

 

三、常见问题

1、经过免疫沉淀后的RNA浓度过低；

2、Input组目的条带无扩增；

3、RNA纯度未在1.8-2.1之间；

4、阴性对照IgG反应中有目的条带。

 

四、注意事项

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNA酶；

2、细胞样本的数量较大，应按照所需要求提供细胞样本数量；

3、选购的相应的抗体应达到IP实验级别，并通过阴性实验反馈结果可信性。