Pfu DNA Polymerase

Pfu DNA Polymerase
Pfu DNA Polymerase是将克隆有Pyrococcus furiosis的DNA聚合酶基因在大肠杆菌中重组表达，经多次柱层析纯化而获得的高纯度、高效率耐热DNA聚合酶。该酶具有5＇→3＇ DNA聚合酶活性和3＇→5＇的外切酶活性(即校读活性)，能够纠正DNA扩增过程中产生的碱基错配现象，适用于对保真性要求较高的DNA片段的扩增，如基因克隆、定点突变、SNP分析等，也可用于DNA片段的末端补平。本产品扩增得到的PCR产物无3＇端突出碱基，不可直接用于T载体克隆。
用途
·   基因克隆、测序
·   定点突变
特点
·   高保真性：高纯度的酶带来优于其它品牌的保真性
·   批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测
产品组分

Pfu DNA polymerase (2.5 U/μl)	100 μl
10 x Pfu Buffer*	1 ml

*含20 mM Mg²⁺
保存条件
-20℃恒温保存一年
活性定义
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃、30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物所需的酶量定义为1个活性单位（U）。
10x反应缓冲液成分
200 mM Tris HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, Stabilizer
质量控制
·   以基因组DNA为模板，可以有效地扩增2 kb DNA片段，荧光测序无突变碱基
·   SDS-PAGE检测显示为一条92 kD的蛋白条带，纯度>98%
·   无内切酶、外切酶污染
·   PCR检测无残留宿主基因组DNA
·   室温存放一周无明显活性降低
FAQ:
Q1: 什么时候需要使用高保真酶?
A1: 凡是对合成链有较高保真性要求的PCR反应，如克隆表达基因、定点突变等，都应该采用高保真酶。
Q2: Pfu酶的保真性能如何?
A2: Pfu酶的突变率约为1.3~2.6 x 10^-6，为Taq酶的6倍左右。
Q3: Pfu酶的扩增速率是多少?
A3: Pfu酶扩增速率较Taq酶慢，扩增1 kb片段需要2分钟左右。
Q4: Pfu酶能扩增多大的片段?
A4: 质粒DNA模板最大可扩增10 kb，基因组DNA模板上限约为6kb。但通常Pfu酶对2 kb以上片段的扩增效率明显降低。
Q5: 如何解决Pfu酶扩增效率低或扩不出的问题?
A5: Pfu的扩增效率比Taq酶低，特别是以基因组DNA为模板时。首先要确认模板的完整性。如需提高目标片段产量，简单的方法是在反应体系中添加少许Taq酶或PCR增强剂。但此方法只限于扩增短片段。扩增较长片段（如4 kb以上），建议使用HiFiTaq DNA polymerase（Cat. No. A116），以确保良好的保真度。
Q6: Pfu酶扩增产物如何进行TA克隆?
A6: Pfu催化的PCR产物是平末端，不能直接用于TA克隆。需要用Taq酶做一步加A反应，然后才可以克隆到T载体中。克隆Pfu酶扩增产物也选用EZ-Blunt平末端载体连接试剂盒 (Cat. No. T170)，直接克隆到经过特殊处理的平末端载体中。
应用实例