EZ-T™ Fast Ligation Kit

EZ-T™ Fast Ligation Kit

EZ-T™ Fast Ligation Kit是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。EZ-T载体是基于pBlueScript II SK(+) 质粒，在EcoRI识别位点处添加了适当序列，经酶切处理后获得具有突出的3’-端T碱基的线性载体。该载体可与Taq 或Tth 等DNA聚合酶催化的携带3’-端A碱基的PCR产物互补连接，以利于下一步克隆或测序。由Pfu、Pwo、Vent或KOD等高保真DNA聚合酶催化反应的PCR产物，也可经Taq DNA聚合酶添加3’-端A碱基后，与EZ-T载体连接。
EZ-T™载体多克隆位点区插入位点两侧均设计了EcoRI酶切位点，因此既可使用EcoRI单酶切，也可使用其他适当的内切酶双酶切，释放插入片段进行检测或亚克隆。EZ-T™载体不含NdeI或NcoI限制性内切酶位点，故可用于克隆含上述酶切位点的基因。DNA测序建议使用M13 Forward和M13 Reverse或T7 promoter和T3 promoter 通用型引物。

用途

·  PCR产物测序和亚克隆
·  利用lac promoter进行基因表达

特点

• 阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10%
• 方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化
• EZ-T™载体含多个常用酶切位点，利于无适当酶切位点DNA片段的亚克隆
• 无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆
• 提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照
• 蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深
• 批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测

产品组分

 

EZ-T™载体 (40 ng/μl)	20 μl
Control Insert（40 ng/μl）	5μl
EZ-T™ DNA Ligase	12 μl
2× Ligation Buffer	300μl

保存条件

 

-20℃恒温保存一年，－80℃长期保存。蓝冰（市内）或干冰（外埠）运输

质量控制

插入DNA对照与载体连接的摩尔比例为3:1时，蓝斑率低于5%，有90%以上的白色菌落含插入DNA对照片段。经测序确认多克隆酶切位点及T碱基存在。

EZ-T™载体环形图谱

EZ-T™载体的多克隆位点区序列

使用方法

1．按下表配制连接反应体系：

组分	样品	阴性对照
EZ-TTM Cloning Vector（40 ng/μl）	1 μl	1 μl
PCR Product	1~4 μl	—
Control Insert（40 ng/μl）	—	1 μl
EZ-TTM DNA Ligase	0.5 μl	0.5 μl
2 x Ligation Buffer	5 μl	5 μl
Sterilized ddH2O	定溶到 10 μl	2.5 μl

注：使用EZ-T连接试剂盒应严格遵循无菌操作规程，以防细菌污染造成试剂盒组分失效。

2．混合，短暂离心。
3．25℃反应5分钟。
4．取2 μl连接反应液加入至50 μl感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5．42℃加热45~60秒钟，冰中放置2分钟。
6．加入800 μl SOC或LB培养基，37 ℃250 rpm振荡培养40~60分钟，使β-内酰胺酶基因表达。
7．在含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养过夜。
8．挑选白色菌落，使用质粒快速提取法（EZ-Lyse克隆快速检测试剂盒，Cat No. T171）或菌落PCR法（EZ-PCR重组菌落PCR检
测试剂盒，Cat No. T172）鉴定是否有插入片段。

FAQ
Q1：TA克隆对PCR产物有何要求？
A1：首先，PCR应使用无校读活性的DNA聚合酶(如Taq或Tth)以确保PCR产物的3’末端有突出的A碱基。使用高保真DNA聚合酶(如Pfu、Pfx、Pwo、Vent、Phusion、KOD等)扩增的平末端PCR产物不能直接进行TA克隆，但可使用Taq DNA聚合酶添加3’-端A碱基后，再与T载体连接。其次，TA克隆最好使用经过纯化的PCR片段。特异性好的PCR产物可不经过切胶回收纯化，但应采用柱纯化或乙醇沉淀的方法去除残留引物、dNTP、引物二聚体等，再与T载体连接，否则影响克隆效率。
Q2：PCR引物设计对TA克隆效率有无影响？
A2：引物的5’-末端设计为G或A更有利于提高TA克隆效果。
Q3：为何有时切胶回收的PCR产物TA克隆效率仍然很低？
A3：经切胶回收纯化的PCR产物具有更高的TA克隆阳性率。然而如果PCR产物在紫外线下暴露的时间过长，会引起DNA变性而降低连接效率。因此切胶时动作要快，尽量减少紫外线下暴露的时间。
Q4：为何有时切胶回收的PCR产物TA克隆后检测发现插入的片段大小不一？
A4：切胶回收应采用新鲜配置的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，否则回收的DNA片段极有可能被凝胶或电泳缓冲液中残留的DNA污染。
Q5：为何有时得到的蓝色菌落也含有插入片段？
A5：1 kb以下的插入片段在没有破坏lacZ基因的读码框的情况下会产生蓝色或淡蓝色的菌落。因此如果观察到整板都是蓝色或淡蓝色菌落时，不妨挑选一些进行筛选。
Q6：EZ-T载体可以克隆的PCR片段大小的上下限是多少？
A6：EZ-T载体推荐用于克隆50 bp~3 kb的PCR片段。经验表明，3 kb以上片段的连接和转化效率比较低，此时可通过加大EZ-T载体用量、适当延长连接时间和使用转化效率高的感受态细胞来提高克隆阳性率。

Q7：EZ-T连接反应产物是否能进行电转化？
A7：使用EZ-T连接试剂盒中提供的2x快速连接反应体系进行连接得到的产物不适于直接进行电转化。连接反应产物须过柱纯化或乙醇沉淀回收后，方可进行电转化。
Q8：EZ-T Ligation Kit应如何保存？
A8：EZ-T Ligation Kit应于−20℃或−70℃保存。2x预混连接反应体系由于含ATP，对温度变化非常敏感，因此融化和使用过程中应置于冰上，单次用量小，应予分装。EZ-T载体和插入DNA对照可耐受10次左右冻融，应避免长时间放置于室温状态以及反复冻融，以免3’-端突出的碱基丢失。
Q9：PCR产物应怎样保存才能保持TA克隆的效率？
A9：PCR产物如不立即用于TA克隆，可于−20℃保存一至两周。长期保存会造成3’-A碱基缺失，造成克隆阳性率下降。也可通过Taq酶加A的方法提高克隆成功率。