免疫沉淀（威斯腾生物-中关村生物医学研发检测共享平台！）

一、原理：

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

1、实验仪器：
高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）
电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）
电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）
转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）
低温高速离心机：湖南湘仪公司（型号：H2050R）
超低温冰箱：美国FORMA公司（型号：702）
分光光度计：上海分析仪器总厂（型号：721）
脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）
2、主要试剂：
HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）
蛋白质预染分子量marker：Fermentas
A蛋白-sepharose珠：Pharmacia Biotech公司产品
NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）
化学发光底物底物：PIERCE公司
电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品
其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品
总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所

二、操作流程

1、样品准备

1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF，混匀，超声波破碎细胞
2）4℃，12000rpm离心10min
3）取上清夜，-70℃冻存24hr
5）4℃ 12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。

2、定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug
3、免疫沉淀

1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50ulPBS
3）取100 μg总蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3 min，以游离抗原、抗体、珠子，8000 rpm室温离心5 min，蛋白上清储于-20℃备用。

4、电泳

1）安装好电泳装置
2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用iso-Propyl alcohol）
3）30min后，待凝后倾去封液
4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干
5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)
6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳
7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳
5、 转膜及检测
1）准备2个Φ12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min
2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min
3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）
4）完全排除气泡， 4℃，100mA转膜2hr。
5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右
6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜
7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗
8）37℃摇床孵育约2hr
9）PBST洗涤4次，每次5min
10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min
11）PBST洗涤4次，每次5min
12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物（A液与B液等体积混和），室温孵育5min后
13）取出NC膜，去尽残液，包好，放入X-光片夹中显影
14）扫描及分析
6、 结果：
用Quantity One 4.3.1(Bio-rad)软件对照片进行分析(注意：Trace表示 Band光密度分布曲线下面积)
（威斯腾生物--原代培养、细胞敲除、模式动物一站式科研服务！）
咨询：023-65316016/ 65316556
本平台可制备的动物模型（部分）

实验服务流程

威斯腾生物服务项目

分子生物学类	蛋白质与免疫学	动物实验
实时荧光定量PCR	单克隆抗体制备	帕金森疾病模型
免疫共沉淀（Co-IP）	多克隆抗体制备	抑郁症动物模型
ELISA（酶联免疫吸附法）技术	Western-blot 实验服务	脊髓损伤模型
生化指标检测	蛋白双向电泳实验服务	脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测	原核蛋白表达纯化	骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀（ChIP）	真核蛋白表达纯化	心肌缺血模型
GST pull Down	ITRAQ定量蛋白质组学	心力衰竭模型
	SLAC蛋白组学	肺动脉高血压动物模型
		高血压模型
病毒类	实验课题整体外包	粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化	整体课题外包	大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化	细胞整体实验外包	慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化	动物整体实验外包	过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化		肺炎大鼠模型
		肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片	原代细胞培养	肝纤维化模型
细胞因子芯片	骨髓间充质干细胞培养	胆结石模型
生长因子芯片	脂肪干细胞培养	急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片	心肌成纤维细胞培养	急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片	软骨细胞培养	体内血栓模型
生长因子芯片	血管内皮细胞培养	关节炎模型
炎症因子芯片	神经元细胞培养	I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片	内皮组细胞原代培养	裸鼠成瘤
凋亡因子芯片		基因编辑动物
趋化因子芯片	电生理相关服务	动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片	膜片钳实验
细胞生物学	高通量测序	代谢组学
细胞原代培养	mRNA测序	气相色谱GC/MS
MTT检测	LncRNA测序	液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测	全基因组测序	核磁共震NMR
细胞周期检测	RNA-Seq测序
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流式分选	Small RNA测序	小动物活体成像
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细胞生物学整体实验		全基因敲除小鼠/大鼠
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扫描电镜	基因定点突变细胞系	LncRNA芯片
透射电镜	单基因敲除细胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除细胞系	mRNA芯片
免疫组化	目的基因敲入细胞系	甲基化芯片（限人和小鼠来源样本）
Tunel（原位末端凋亡法）检测	报告基因敲入细胞系	SNP芯片（限人和小鼠来源样本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除细胞系
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动物跑台检测	分子药理研究平台	泌尿系统药物药效学评价
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	常规药物体外筛选	抗炎免疫药物药效学评价

【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！