PKCθ mRNA原位杂交试剂盒 基因结构和功能

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北京百奥莱博科技有限公司专业生产供应PKCθ mRNA原位杂交试剂盒 基因结构和功能，产品信息：

类别：基因结构和功能

产品名	产品编号	包装规格
PKCθ mRNA原位杂交试剂盒	ZN1138	100T

编号：ZN1138

品牌：百奥莱博

规格：100T

基本信息：

保存条件：4℃保存一年

工作量：100张切片。

有效期：一年。

适用种属：hμman,rat,mouse

标记方式：3’—尾段标记

试剂盒中内容：

1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；

2.预杂交液 2ml；

3.PKCθ mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；

4.封闭液 5ml；

5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；

6.SABC-POD 5ml；

7.生物素化过氧化物酶 5ml。

用户自备试剂：

原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油

缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)

一．培养细胞和冰冻切片

准备工作：

固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)

3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。

2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。

0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。

0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。

20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。

原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。

操作程序：

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染，充分水洗。

16.酒精脱水，二甲*透明，封片。

二．石蜡切片

如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。

1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。

3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。

结果观察：

PKCθ的细胞胞浆着色呈棕黄色。

注意事项：

由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

PKCθ mRNA原位杂交试剂盒 基因结构和功能专业优质供应商：北京百奥莱博科技有限公司

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编号	类别	名称
ZN0140:基因结构和功能	BMP-7 mRNA原位杂交试剂盒
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ZN1421:基因结构和功能	Topoisemerase IIα/TOPIIα mRNA原位杂交试剂盒
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ZN1140:基因结构和功能	PKCξ mRNA原位杂交试剂盒
ZN1470:基因结构和功能	VCAM-1/CD106 mRNA原位杂交试剂盒
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