CIMmultus™ r-Protein L-8 质粒纯化大

CIMmultus™是一种新型改进的预包装色谱整体柱，其特点是大流量通道，可用于处理大分子蛋白（IgG，IgM，PEG化蛋白），病毒（AAV，腺病毒，慢病毒，流感，噬菌体） ，VLPs和pDNA。 由于其性能特点，CIMmultus™色谱柱可以用作一次性或多次使用的色谱柱。 CIMmultus™的一个重要特征是其柱套： 由环氧热固材料制成并用碳纤维增强，使色谱柱具有与不锈钢相同的结构强度；CIMmultus™色谱柱符合cGMP标准。 BIA由一群科学家和风险投资者于1998年创立。他们的共同目标是通过开发用于制备应用的单块材料，成为创新生物色谱的世界。基于15年以上的经验，BIA Separations开发了各种CIM对流相互作用Media®整体柱，满足了对治疗性生物分子净化中强大且节省时间的解决方案日益增长的需求。通过内部计划和外部合作，这家ISO认证的公司在研究，开发，生产和客户服务方面追求最高质量标准。此外，BIA Separations利用其在液相色谱方面的专业知识来开发和验证分析方法并设计工业纯化流程。我们致力于为客户提供最具可重复性和创新性的产品，以满足他们当前和未来的分离需求。是整体柱分离技术者，将继续成为创新型生物色谱领域的者。BIA品牌的CIM产品在2004年用于勃林格殷格翰制药的质粒DNA工业cGMP纯化上，相比传统色谱柱整体提高了15倍的生产力；并且给安捷伦Bio-Monolith生产线做代工；已经通过FDA认证（根据美国GMP规定） JAZMP认证（根据欧盟GMP规定） ISO 9001: 2008 等认证。

质粒是常见的分子生物学工具，是一段 DNA 双螺旋结构。而抽提质粒几乎是分子生物学基础实验之一。

  科研水平的实验，通常的质粒抽提试剂盒就足以满足微克至数毫克级的需求，但是如果需要大规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量就非常的力不从心了。
此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒大小、序列都不一样，上游表达量也有区别，甚至稳定性都有差异。

   面对如此众多品种的质粒，有没有一种质粒 DNA 纯化平台，能够适用多种质粒的、可放大的，满足基因治疗、细胞治疗和疫苗的高纯度和同质性的标准要求，并且还需要有效，稳健和可扩展的下游过程呢?

 

   接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
该方法除了具有以上全部优点，并且可以明显降低纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液

1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。

操作建议：

  先收集菌体；
  然后采用碱性裂解法制备原料；

  再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

  通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩：

氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质

  裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

  在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:

1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;

5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。

（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）

 

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。

*步纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；

*步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

 

 AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

  在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。 

  随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

 

层析条件

Monolithic column:	CIMmultus™  DEAE(2 μm)*1
Mobile phase:	Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2
	Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2
	Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

1.  用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2.  将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3.  将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5.  用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6.  用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7.  用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

 

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

 

    在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从        超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

    为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。 

    该步骤进一步去除了杂质。

 

层析条件

 

Monolithic  column:	CIMmultus™ C4  HLD (2 μm)*2
Mobile phase:	Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow  rates:	0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

 

1.  调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。

3.  将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。

4.  用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。

5.  用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。

7.  加样 3 次后，对柱子进行清洗。

 

图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA

 

·  从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。

·  缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。

·  配置和填充可能需要额外的处理。

二步法层析过程分析：

 

  质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

 CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。

 CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。