一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)哪里买

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)哪里买的品牌：百奥莱博，是优质的克隆与表达产品，用于生化研究，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)等克隆与表达产品请联*(代"系")我司咨询订购。

名称：一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)哪里买
品牌：百奥莱博
英文名：One-Stop TA Cloning Kit(B)
编号：BTN90801B
规格：20次
TA克隆就是利用T载体两个3´端各带有一个T突出，而PCR扩增产物两个3´端各带有一个A突出的特点，在DNA连接酶的作用下，将PCR产物克隆到T载体中的过程，它是克隆PCR扩增产物的主要手段。

产品特点：
1.一站式，用户只需要准备PCR产物即可进行TA克隆。
2. T载体由Xcm I酶切方法制备，两个5´端100%含T突出，自连率几乎为零。
3. 克隆效率高，一次TA克隆实验一般能得到上百个重组子。
4. 阳性率高，一般能到90%以上，大大缩短了筛选工作。
5. 提供供两次实验用的对照插入片段，方便分析实验数据。
6. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I)，便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
7. 克隆位点两侧分别有T3和T7 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
8.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
9. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
10.含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。

成分	规格
即用型蓝白T载体(50ng/μL)	20μl
对照插入片段(50ng/μL)	5μl
T4快速连接缓冲液，2×	100μl
T4 DNA连接酶(5U/μL)	30μl
超纯水	1ml
高效感受态细胞	100μL×10只(只B型有)
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。感受态细胞需要干冰运输，-70℃保存，有效期6个月。

自备试剂：插入片段。

使用方法：

一：PCR产物的纯化和定量注意事项
1. 由于PCR体系中有大量会抑制DNA连接反应的dATP、还有一些可能在电泳胶上不一定会显示出来的非特异性扩增产物和引物二聚体，所以PCR产物必须用胶回收方法制备才能用于本试剂盒的连接。可以分别使用本公司柱式DNArc(BTN60202)和PAGE DNArc(包括柱式PAGE DNArc)从琼脂糖胶和PAGE胶上纯化回收PCR片段。具体操作见相关产品使用手册。
2. 琼脂糖胶回收的电泳缓冲液最好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
3. 为避免UV对DNA的伤害，切胶最好在日光下进行(使用百奥莱博的绿如蓝染料的话，可以直接在黑色背景下看见DNA条带，不需要紫外光)。如果使用EB或其他染料，必须在紫外下切胶时，最好选择长波(360nm)紫外灯并以最快速度切胶，文献报道短波UV(300nm和240nm)会使DNA连接效率降低400多倍。使用短波UV时，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)减少伤害。
4. PCR片段的体积越小越便于后续操作。洗脱PCR片段时，用最少量的洗脱液洗脱。
 本试剂盒要求PCR回收片段的浓度最好为50ng/μL。如果浓度不够，最好用醇沉淀法沉淀后直接在管内设置连接反应，也可以使用本公司的核酸浓缩剂(BTN110801)直接浓缩。
5. 为准确定量回收的PCR产物同时又节约样品，最好使用微量分光光度计(只需用1μL样品测量)。如果分光光度计需要大量样品，建议使用电泳法定量：将回收的PCR片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的相对荧光强度而估测PCR产物的浓度。

二：连接反应
1. 短暂离心装有蓝白T载体、连接缓冲液和T4连接酶的离心管。
2.在三个离心管中加入下列成分(注意，对照可以不做，在出现问题时再做)：

成份	样品管	阳性对照管	自连对照管
T4快速连接缓冲液，2×	5μl	5μl	5μl
蓝白T载体(50 ng/μL)(=0.03 pmol/μL)	1μl	1μl	1μl
自备PCR 纯化产物(0.03-0.1 pmol/μL)	Xμl(见注)	不加	不加
对照插入片段(50ng/μL)(=0.06 pmol/μL)	不加	1.5μl	不加
T4 DNA连接酶(5U/μL)	1-1.5μL	1-1.5μL	1-1.5μL
超纯水	补到10μL	补到10μL	补到10μL

注: 如何根据T载体的用量计算PCR纯化片段的最佳用量？
第一：确定插入片段与载体的最佳摩尔比，在本产品的T载体的长度固定(3Kb)时，最佳摩尔比跟插入片段的长度关系如下：

插入片段长度	与载体的摩尔比
1Kb以下	2:1或3:1
跟T载体接近(±1Kb)	1:1
比T载体长1Kb或更多	1:2或1:3

第二：根据选定的最佳摩尔比按下面方程式计算用量：

本产品提供的T载体长度为3 Kb，推荐用量为50ng，如果PCR片段长度为0.5 Kb，最佳摩尔比设定为3:1，则其用量为:

3. 用移液器吹打连接反应液使之混匀，然后放置在16℃孵育30分钟-过夜。
4. 65℃5分钟灭活连接酶后直接用于转化或-20℃保存。

三：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
1. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
2. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。
3.在冰上放置30分钟。
4. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
5. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
6. 将100μL复苏涂布到含Amp的LB琼脂平板上(也可加上X-gal和IPTG)。
7.室温4,000rpm离心剩余的900μl复苏细胞5分钟，弃去800μl上清，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
8. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
9. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组总共会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR回收片段的质量。
10. 按常规方法筛选重组子。

MCS位点：


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·IPTG溶液
编号：BTN80909
英文名称：IPTG Solution
规格：1.5mL
本产品为浓度为200mg/mL的无色液体。IPTG是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ基因载体DNA)以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时，或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X-Gal和IPTG，由于β-半乳糖苷酶的α-互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

·柱式分枝杆菌DNA提取试剂盒
编号：BTN70703
英文名称：Mycobacteria DNA column extraction kit
规格：50次
分枝杆菌属(Mycobacterium)是极为古老的细菌，与人类的疾病相关的就有25种以上，包括引起结核病的结核分枝杆菌(Mycobacteria tubercμLosis)。近年来由于多重耐药性分枝杆菌的出现，分枝杆菌再次成为人们关心的细菌。PCR快速诊断是目前检测分枝杆菌的主流方法，但由于此类细菌具有十分独特的坚硬的细胞壁，快速提取其基因组DNA一直是十分棘手的技术问题。本产品就是为解决这一问题而开发。

试剂盒特点：
1. 操作简单，客户不需要准备额外的试剂。
2. PCR检测灵敏度一般在10-100CFU/mL样品。
3. 既可以使用培养的细菌，也可以使用痰液、精液、血液、脑脊液等样品。
4. 价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜。
5. 安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味。

试剂盒组成：

成分	规格
化痰液	100ml
溶液A	7.5ml
溶液B	15ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
DNA洗脱液2.0	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，有效期一年。

使用方法：
注意：文献报道部分分枝杆菌在DNA提取过程中还有形成菌落的能力，所以任何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待，并严格按有关部门要求进行消毒处理。

一:培养的分枝杆菌样品的预处理
1. 刮取培养的分枝杆菌到0.5mL自备TE缓冲液中。
2. 80℃放置20分钟以杀灭细菌。
3. 3000 g室温离心15分钟，弃上清。
4.细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。
二:含分枝杆菌的痰液样品的预处理
1. 将需要处理的痰液样品加入到干净的10mL或15mL塑料离心管中。
2. 加入等体积的化痰液，充分混合均匀后室温放置15-30分钟。如果痰很浓，可以延长保温时间。
3. 3000 g室温离心15分钟，弃上清。
4.细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。
三:含分枝杆菌的血液样品的预处理
1. 用自备红细胞裂解液对血液进行红细胞裂解处理，具体操作见百奥莱博红细胞裂解液(BTN60403)使用手册。
2. 将得到的白细胞沉淀-20℃或更低温度放置10分钟。
3. 迅速将得到的白细胞沉淀100℃加热10分钟。
4.上述处理将使大部分白细胞破裂，加入自备的TE或PBS缓冲液,直到离心管体积的一半位置。此步使白细胞的DNA进入缓冲液中。
5.离心5-10分钟沉淀细菌，离心速度取决于离心管的大小。如果样品在1.5mL离心管，则可以12000～15000g室温离心。如果样品在10-15mL离心管，则3000-5000g室温离心。
6. 吸弃上清(含白细胞DNA)后所得细菌沉淀可以放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。
四:细菌基因组DNA的提取
1. 将150μl 65℃预热过的溶液A加到有细菌沉淀的离心管中，充分震荡混匀。
2. 将细菌和溶液A的混合物转移到一个干净的1.5mL塑料螺旋盖离心管中。强烈建议不要使用压盖式塑料离心管，否则后面处理过程中溶液容易漏出。
3. 加入300μl溶液B和300μl自备*仿，充分震荡混匀。
4. -20℃放置直到液体凝固，一般需要20-60分钟。过夜放置也可。
5. 放室温融化后振荡半分钟。
6. 12000～15000g室温离心3～5分钟，小心转移上清到离心吸附柱中，室温放置2分钟。
7. 12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加入0.5mL通用洗柱液 12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 重复第8步的洗涤过程一次。
10. 短暂离心半分钟。此步不要省略，否则残留的洗柱液(含乙醇)将会影响DNA电泳、酶切和PCR等反应。
11. 将离心吸附柱转移到一新的离心管中，加入30-100μL DNA洗脱液2.0，12000～15000g室温离心半分钟，所得溶液即基因组DNA。

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