大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞 克隆与表达

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞 克隆与表达，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞 克隆与表达
英文名：E.coli OrigamiB(DE3) Chemical Competent Cell
品牌：百奥莱博
编号：BTN120520
规格：10*100μl
产地：国产|进口
 本产品是采用大肠杆菌Origami B(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测本产品，转化效率可达107。本感受态细胞具有卡那霉素和四环素抗性。
 菌株基因型为：F-ompT hsdSB(rB- mB-)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA 所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入450μl 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项：
1. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

我公司的大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞 克隆与表达，性价比高，货期短，送货上门，欢迎您来电咨询购买，另外，我公司还生产供应销*(代"售")下列产品：

·大片段Bst DNA聚合酶
编号：BTN100209
英文名称：Bst DNA Polymerase，Large Fragment
规格：800U
Bst DNA聚合酶大片段是将缺少5´→3´外切核酸酶结构域的Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)DNA聚合酶基因在E.coli中表达纯化而得。

产品特点：
1. 5´→3´DNA聚合酶活性，但不具有5´→3´外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。
2. 嗜温性，最适反应温度为68℃，建议反应温度不要超过70℃。
3. 强链置换能力，可以用于DNA链置换反应和LAMP扩增。还可用于68℃DNA测序(该条件尤其适用于富含GC的模板和纳克级的模板)。
4. 不能用于热循环测序或PCR，80℃ 10分钟即可失活。

产品组成：

 

成分	规格
Bst DNA聚合酶(8U/μL)	100μl
10×Bst Buffer	1.5ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存、有效期一年。长期贮存需补加100μg/mL BSA或0.1% Triton X-100。

1×Bst DNA聚合酶Buffer的组成：20mM Tris-HCl(pH8.8 @ 25 ℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1% Triton X-100

活性定义及检测条件：1 U 指65℃条件下，30分钟内使10nmoL的dNTP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。活性检测条件为：50mM KCl，20mM Tris-HCl(pH8.8),10mM MgCl2，30 nM M13mp18 ssDNA，70 nM M13 测序引物(-47)24 mer，200μm dATP，200μm dCTP,200μm dGTP,100μm[3H] dTTP，100μg/mL BSA和酶，65℃温育。

贮存条件：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.1% Triton X-100和50%甘油，贮存于-20℃。


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·链霉亲和素
编号：BTN131021
英文名称：Streptavidin
规格：1mg
本产品为通过亲和层析纯化获得高纯度链霉亲和素。链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66KDa，一条完整的SA肽链中有159个*基酸残基，一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10 mol/L 数量级，这一性质常用于分子生物学用途。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·SP6体外转录试剂盒
编号：BTN91107
英文名称：SP6 in vitro Transcription Kit
规格：50次
本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有SP6启动子的模版DNA，以NTP为底物，从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 kb片段)	20μL(10 ng/μL)
SP6 RNA聚合酶混合液	50μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将SP6启动子序列(5´ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3´)加上，转录其实是从3端G AGN G中的第一个G开始。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3´突出。如果是3´突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板	xμL	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50 ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
SP6转录预配液(2×)	10μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活SP6 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用等体积(100μL)的Tris饱和酚-*仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1. 没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2. RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3. RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有SP6 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4. RNA长度比预计的长。SP6 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5. 5´单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则SP6 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5´端是单磷酸的比例将大大增加。
6. 如何得到带帽RNA？需加入带帽NTP类似物即可，本公司提供5种供选择。


大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞 克隆与表达关键词：BTN120520,大肠杆菌OrigamiB(DE3)化学感受态细胞,E.coli OrigamiB(DE3) Chemical Competent Cell


·RNase A溶液(10mg/mL)
编号：BTN3160
英文名称：RNase A Solution(10mg/mL)
规格：1.5mL
本产品是浓度为10mg/mL的RNase A溶液，不含DNase和蛋白酶活性，可以用于DNA提取(包括质粒DNA提取)时和蛋白质纯化时去除RNA污染。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。


·Hoechst 33342干粉
编号：BTN130865
英文名称：Fluorescent Dye Hoechst 33342，Powder
规格：10mg
Hoechst 33342是一种可透过细胞膜并对DNA染色的细胞核染色试剂，它在嵌入双链DNA后释放强烈的蓝色荧光。Hoechst 33342常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342-DNA的激发和发射波长分别为350nm和460nm。

CAS号：23491-52-3
分子式：C27H28N6O·3HCl
分子量：561.93

储存条件：低温运输，-20℃干燥避光保存，有效期一年。

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