CRISPER-CAS系统稳转细胞系构建

实验 Q&A：如何用慢病毒转染构建稳转细胞系

这里说的稳转细胞系的构建是指慢病毒转染构建的稳转细胞系，可以构建表达细胞系，也能构建敲降细胞系，经常有人问我什么叫稳转和顺转的区别。瞬转细胞系，一般情况下能够稳定表达最多长一周左右，而稳转细胞系，只要构建成功就能稳定表达，没有时间限制，但是也不是肯定的，一般实验构建的细胞系超过 10 代以后，这个细胞系就有可能不靠谱了。接下来，咱们讲讲稳转细胞系的构建。一般来讲 shRNA 用的是 HIV 病毒，虽然已经经过处理，但是一听这名字也觉得渗人，无论如何保护自己是在实验室永葆青春的基础，所以一定

【原创】基因组编辑三大工具ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol

的上下游序列， 设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择部分阳性克隆进行PCR产物或做T载克隆送测序进行最终确认。目前推崇的各种识别错配碱基的酶切鉴定方法及Surveyor assay试剂盒由于假阳性过高及过于昂贵，一般实验室我们不建议使用。少数试剂酶公司对于酶的推荐有利益因素驱动，希望各位战友注意甄别，土豪请忽略。(*^__^*) 运用CRISPER-Cas9技术进行癌细胞系的基因敲除，我们的经验是若设计的CRISPER-Cas9载体表达水平够高，敲除效率够高，此步骤多数时候可以直接

Nat Methods：陈玲玲/杨力/李劲松等开发新技术，实现环状 RNA 功能性筛选和研究

胚胎中的 circRNA 表达，而不影响对应的线性 mRNA。此外，研究人员还发现 circMan1a2 参与小鼠胚胎早期发育。 小结 （图源：中科院官网）陈玲玲、杨力、李劲松研究团队基于 CRISPR-Cas 系统成功开发了 CRISPR–RfxCas13d， 后者可通过 gRNA 靶向 circRNA 反向剪接位点（BSJ）实现对 circRNA 和线性 mRNA 的区分。基于该技术，研究团队成功构建了靶向人类高表达 circRNA 的反向剪接位点序列的慢病毒文库。通过筛选构建文库，研究团队发现