一步定向无缝克隆试剂盒说明书

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括一步定向无缝克隆试剂盒说明书在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：一步定向无缝克隆试剂盒说明书
品牌：百奥莱博
英文名：One step directed seamless cloning Kit
规格：20次|100次
编号：JN0001
  本试剂盒可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至20分钟，阳性率达到95%以上，让您轻松完成实验。

试剂盒组成：

 

组份	JN0001-20次
BalbRec 重组酶	20μl
10×重组缓冲液	50μl

收到后请立即离心；可在-20℃长期保存，避免反复冻融

产品特点：
1、无酶切位点限制，无多余序列；
2、PCR产物无需酶切，一步克隆；
3、克隆效率高，阳性率＞95%；
4、省时省力，操作简单；
5、多片段定向拼接，妙用无穷；
6、定向克隆，任意载体。

使用方法：
A.线性化载体的获得

线性化载体可以通过两种方法获得，不管采取哪种方法，最终线性化载体的 浓度需>15ng/μl。(高浓度的载体有利于提高效率)。
1、酶切选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，并且5´端突出，3´端突出或平末端均适用本Kit。
2、PCR 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp 左右，一般载体长度均大于3kb，建议用高保真的聚合酶扩增（推荐使用 百奥莱博pfu DNA 聚合酶，货号：JN0016）。为了避免模板质粒DNA对后续 试验的影响，建议载体酶切后再用PCR扩增，自连背景更低，阳性率更高。

B.目的片段获得
目的片段通常通过PCR获得。引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与 线性化载体的两端一致，特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证PCR扩 增的特异性及灵敏度，请尽可能选用pfu等高保真酶（推荐使用百奥莱博pfu DNA聚合酶，货号：JN0016）。PCR每条引物长度至少在35-40bp，包括5´ 端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp，（注意事项：如果是 表达载体克隆构建，引物设计完全后，请注意检查读码框的正确）。引物设 计方法：使用BalbRec PCR一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）时，引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引物要加上15-18bp的载体同源序列。
载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：
(1)载体酶切后是5"端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5"端突出部分的序列；
(2)载体酶切后是3’端突出，则因无上的同源序列不包含突出部分。（如下图，红色碱基为希望保留原有的酶切位点所额外添加的碱基，不计算在15bp之内。
注：15bp同源序列不要求严格从载体最末端一届碱基计算，这是载体末端非同源序列将会被删除，同时导致重组效率的下降。当非同源序列达到20bp时，效率下降一半。

BalbRec 一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）引物设计方法

C.目的片段与载体的重组
1.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中 进行重组反应
2.混匀后在37℃放置20分钟;
3.立即进行转化，剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。（注意：1.目的片段与载体的摩尔比在3：1-10：1之间，摩尔比低于3：1效率会降低 2.反应时间在20-40分钟，时间太长不利于重组反应）

D.转化
建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5X106 cfu/μg.
1.冰上融化一管100 μl的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细 胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45分钟。
2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
3.加入500μl S℃液体培养基，37℃孵育45-60分钟。
4.5k离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定
一般的，我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用百奥莱博2x specificTM PCR MasterMix 货号：JN0034)。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。

常用反应体系

试剂	体积
10×重组缓冲液	2μl
BalbRec 重组酶	1μl
线性化载体（>15ng/μl）	N
插入片段	N
ddH2O	至20μl

注：载体与目的片段的摩尔比在1:3～1:10之间，如果摩尔比低于1:3，转化效率会下降。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

一步定向无缝克隆试剂盒说明书极具性价比，此外，我公司正火爆促销以下产品：
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一步定向无缝克隆试剂盒说明书关键词：JN0001,一步定向无缝克隆试剂盒,One step directed seamless cloning Kit

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298-96-4 TTC  2,3,5*化三*基四氮唑
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一步定向无缝克隆试剂盒说明书关键词：JN0001,一步定向无缝克隆试剂盒,One step directed seamless cloning Kit


·重组人OBFC1(含寡核苷酸结合折叠域蛋白1)
编号：JN1006
英文名称：Recombinant Human Oligosaccharide-Binding Fold-Containing Protein 1
规格：10μg|50μg|500μg|1mg
本品由我们的大肠杆菌表达系统制备而成，目的基因编码的Met1-Phe368在N端含有His标签。

OBFC1质量控制：＞95%(还原性SDS-PAGE)

OBFC1制剂：冻干品

OBFC1保存：
冻干蛋白置于-20℃以下可长期保存，室温条件下可稳定保存3周。
复溶蛋白溶液可在4～7℃保存2～7天，可分装后置于-20℃保存三个月。

OBFC1复溶：
打开试剂管前请先离心。
复溶浓度推荐大于100 μg/ml。
冻干蛋白请溶于ddH2O。
复溶后，请根据用量分装冻存，避免反复冻融。

关于OBFC1：
CST Complex Subunit STN1 (OBFC1) is a 368 amino acid protein that contains one OB DNA-binding domain. It is a member of the STN1 family. OBFC1 is component of the CST complex, a complex that binds to single-stranded DNA and is required to protect telomeres from DNA degradation. The CST complex binds single-stranded DNA with high affinity in a sequence-independent manner, while isolated subunits bind DNA with low affinity by themselves. In addition to telomere protection, the CST complex has probably a more general role in DNA metabolism at non-telomeric sites.

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