外泌体microRNA实时荧光定量PCR检测

MicroRNA(miRNA)荧光定量PCR技术

加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA，长度太短，并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。 图二 miRNA 实时荧光定量PCR

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超速离心：差速超速离心是大家最熟悉的一种分离方法，文献中用得最多的且也是目前比较能受到认可的方法。差速超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法分离得到的外泌体可用于后续的鉴定实验、分子检测实验、细胞实验和动物实验。 密度梯度离心：此方法多指蔗糖密度梯度超速离心。此方法从不同密度的颗粒中分离出囊泡，对离心的时间比较敏感。如果外泌体和颗粒密度相似，外泌体可能会被其他颗粒污染。 超滤：超滤过程中需要用超滤膜进行外泌体隔离。在分离过程中，外泌体可能会阻塞

干货：外泌体研究实操中的常见问题解答

、外泌体 miRNA qPCR 实验选用哪个基因做内参？ 答：外泌体 qPCR 目前没有公认内参基因，本公司检测 miRNA 做的是外参。外参可以最大限度降低对定量实验造成的干扰，适用于内参表达不稳定的外泌体或暂未发现合适内参的其他样品，对目的 microRNA 进行相对定量，替代内参作用。部分文献也会选取U6等作为内参。 16、下游 qPCR 检测时 CT 值过高如何处理？ 答：外泌体 RNA 是微量的存在，首先样品准备阶段确保样品的质量和数量充足（例如血清建议新鲜样本准备 2ml 以上）。有实验