可保种型蓝白T载体促销

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")可保种型蓝白T载体促销，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：可保种型蓝白T载体促销
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
规格：50 ng
英文名：Blue-White Vector T
本产品是环状的可以制备Clion蓝白T载体的质粒DNA。T载体是克隆PCR扩增产物的必不可少的工具，但是由于市场上的各种T载体质量参差不齐，用户很难购买到满意的产品；同时购买的T载体为线性DNA，不能保种，必须反复购买，累计成本很高。为解决这一问题，我司特推出可保种型T载体，用户只需要购买Xcm I内切酶就可以自己制备高质量的T载体，随用随配，十分方便。

产品特点：
1.一次购买，终身拥有。本产品提供制备T载体用的环形质粒DNA，可以象其他质粒一样保种并长期保存。
2. 随用随配，十分方便。用户只需要提供Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件，就可以自己制备T载体。整个过程只需要两天。
3. T载体含T 率为100%。本方法不是使用传统的加尾法，而是使用Xcm I酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为1.3 Kb的Xcm I DNA片段,经Xcm I酶切后回收得到的质粒DNA(T载体)两端自然全部带有T 突出，比例远远高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T载体。
4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白T载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点，便于后续克隆； Xcm I 位点在Alpha 互补区，可以使用蓝白斑筛选重组子；两边还有T7和SP6 RNA聚合酶启动子，便于制备RNA探针。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

使用方法：

一.细菌的转化
1. 将100μl感受态细胞于冰上解冻。注意：最好使用end A1菌种(如DH1、DH5、DH5、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考《分子克隆手册》等参考书)。因为这类细菌所含DNase少，制备T载体后，残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。
2. 取5-10μl本产品加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟。
4. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时。
5. 取100μl培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。

二.细菌的鉴定
1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。
2. 按常规的方法进行质粒小量制备。
3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA，如果大规模酶切，需要按比例增加各成分用量:

 

成分	使用量
Xcm I Buffer,10×	5μl
质粒DNA	<或= 2μg
Xcm I	1μl
超纯水	加到50μl

 37℃保温一小时，65℃保温20分钟使酶失活。
4.电泳，本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。
5. 如果Xcm I酶切图谱正确，则按常规的方法进行细菌的保种。

三. T载体的制备
1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意：一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质(含残留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切质粒。注意：酶切时间最好不要超过一小时，避免残留的DNase对T末端的破坏。
3.电泳后切下含3Kb DNA(既蓝白T载体)的胶段。注意：千万不要用UV照射将要回收的片段，因为UV会使DNA交连，使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奥莱博绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择，最好在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)
4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。
5. 测定T载体DNA的浓度后，将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。

四.连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分：

成分	样品管	阴性对照管
T4 Ligase Buffer，10×	1μl	1μl
蓝白T载体	20-50ng	20-50ng
PCR 纯化产物	50-500ng	不加
T4 Ligase	3-5U	3-5U
补水到	10μl	10μl

注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3:1-10:1。
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作说明书进行连接)。

五.细菌转化和鉴定
1. 取5μl连接产物进行转化，具体步骤见本手册一，最好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。
2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定，可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选，可选用百奥莱博的菌落PCR试剂盒(BTN50901)进行快速筛选，需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。

MCS位点：


我公司的可保种型蓝白T载体促销，性价比高，货期短，送货上门，欢迎您来电咨询购买，另外，我公司还生产供应销*(代"售")下列产品：

·DNA marker(λDNA/HindIII)
编号：BTN90602A
英文名称：DNA ladder(λDNA/HindIII)
规格：50次
 本系列产品为传统的酶切分子量标准，由单一的质粒DNA或噬菌体DNA经单个限制性内切酶完成消化后，加热灭活而成。每次上样总DNA含量已知，每条带的含量可根据其摩尔数的比值计算出来。本系列产品成分中已经含有上样缓冲液，所以可以直接上样电泳。得到的电泳条带长度准确，明亮清晰，背景较低，稳定性很好。
 每次加样量为5μL，可用于相对定量。本系列产品与各种琼脂糖和各种电泳缓冲液兼容。


储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：直接上样电泳，每次加样量为5uL。

使用效果：


疑难解答：
a)如对带型要求较高，建议使用0.8-1.5%琼脂糖凝胶(对SuperBuffer-2缓冲液，电压为250-400V)或1.5-2.0%琼脂糖凝胶(对TAE或TBE缓冲液，电压为80V)，同时适当延长电泳时间。
b)电泳图象的质量与琼脂糖、电泳缓冲液有关。请采用高质量的琼脂糖，同时要经常更换电泳缓冲液。

·动物RNA提取试剂盒(柱式Trizol)
编号：BTN71201
英文名称：Animal RNA column extraction kit(Trizol)
规格：50次
本试剂盒是动物总RNA快速提取试剂动物RNA提取试剂盒(BTN3070)的柱式升级产品，可用于从各种动物组织(包括白细胞)快速提取总RNA。

试剂盒特点：
1. 操作更加简单快速，整个过程只需要不到十分钟(对一个样品而言)。
2. RNA 纯度更高，OD260/OD280一般在2.0左右。
3.一般不含用RT-PCR可以检测到的基因组DNA污染。
4.适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。
5. 得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA 合成等实验。
6. 性价比高于进口的柱式RNA提取产品。

试剂盒组成：

成分	50T
溶液A	50ml
溶液B	25ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA 洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
下面的操作步骤是针对在1.5mL塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。

1. 根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10 平方厘米细胞中加入1mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106 悬浮细胞中加入1mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1mL溶液A的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c)对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg 组织加1mL溶液A，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA)，建议组织的使用量不要超过50mg/ mL溶液A，否则十分容易产生DNA污染。
d)对RNAhold 保存组织：先用纸吸去RNAhold液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备*仿(1mL溶液A需0.2mL *仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
3. 12000rpm室温离心3～5分钟。
4. 将上清液(约0.6-0.8mL的无色透明水相，有时水相比重大时，水相在下层，有机相即蓝相在上层，吸取时应吸取透明水相)转移到一个干净的1.5mL塑料离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100μl上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。
6. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
7. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加0.7mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
9. 加0.3mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
10.室温12000 rmp离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。
11. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50-100μL RNA 洗脱液。
12.室温12000 rmp离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA的电泳检测：本试剂盒提取的RNA 最好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶(in TAE或TBE buffer)上电泳，一定要使用RNA 专用上样液RNAload(操作详见RNAload 使用手册)，千万不要使用常用的DNA上样液，因为DNA上样液没有经过去RNase处理，也不能将RNA变性，得到的带型将十分杂乱。
14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。
15. RNA产量产率测定：将5-10μl RNA 溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA 纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

疑难解答：
Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA污染吗？
A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，我们初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼*(代"酸")络合(如果使用TBE作电泳液的话)形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳和RNA 专用上样液(如RNAload)。
Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？
A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用百奥莱博的非酶的DNA去除剂DNA Scavenger或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。


可保种型蓝白T载体促销关键词：Blue-White Vector T,可保种型蓝白T载体,BTN60803


·8M盐*(代"酸")胍溶液
编号：BTN100408
规格：250mL

·基因转染增强剂
编号：BTN140621
英文名称：Hexadimethrine bromide
规格：0.5mL
聚凝胺Polybrene又名为*化己二甲铵、海美*铵，CAS号：28728-55-4。聚凝胺是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强转染效率。Polybrene 增强转染效率原理图如下：


产品特点：
1．Polybrene广泛应用于脂质体转染、逆转录病毒介导的基因转染及慢病毒介导的基因转染等实验，可以显著提高各种逆转录病毒、慢病毒及脂质体的转染效率。
2．Polybrene对某些细胞(如末端分化的神经元，DC细胞)毒性较大，初次应用建议先做毒性测试。
3．Polybrene还是一种有效的抗肝素剂(肝素拮抗剂)，常用来生产非特异性凝集的红细胞；还可用于蛋白测序，小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象；PVDF 膜上加入Polybrene能提高膜的亲和性。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

慢病毒感染举例：
1．第一天按实验需要将细胞铺板(比如24孔板)。细胞数以第2 天密度约50%为宜。37℃培养过夜。
2．第二天感染前，从-80℃冰箱取出病毒，冰浴融化，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI 值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度。
 注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。
3．吸去细胞原有培养基，将按照MOI 稀释好的病毒液+培养基+ Polybrene(对于293细胞，终浓度6μg/mL)加入细胞中，轻轻摇匀。37℃培养过夜。
 注：病毒液-培养基-Polybrene 混合液，按如下操作制备混合液：
①添加完全培养基(60mm培养皿2mL，100mm培养皿3mL)，37℃预热；
②加入病毒轻轻混匀；
③加入Polybrene 至终浓度为2μg-12μg/mL。
轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。当MOI高于20时，建议客户添加Polybrene(终浓度2～12μg/mL，浓度因不同的细胞而异，具体的请参考相关文献)来提高病毒的感染效率。如果感染目的细胞是Jurkat，kasumi，NB4，H929，GBC-SD，MCF-7等，建议不要添加Polybrene；大部分原代细胞感染也不需要添加Polybrene，以上仅供参考。
4．感染48小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。
5．继续培养24～48小时后，根据需要收集细胞检测目的蛋白的表达。

质粒转染：
1．第一天按实验需要将细胞铺板(比如24孔板)。细胞数以第2 天密度约50%为宜。37℃培养过夜。
2．准备 DNA-培养基-Polybrene混合液。按如下操作制备混合液：
①添加完全培养基(60mm培养皿2mL，100mm培养皿3mL)，37℃预热；
②添加10ng～10μg质粒轻轻混匀；
③加入Polybrene 至终浓度为5μg-10μg/mL。
 轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。
3．去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-Polybrene溶液，在37℃孵育细胞6-20h。细胞培养的前6h内约每1.5h 轻柔混匀。
4．去除 DNA-培养基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution(15%DMSO in 1×HBSS)轻轻盖住细胞(60mm培养皿3mL，100mm培养皿4mL)。每次加入溶液时用手轻晃培养盘10s，使得液体均匀分布。然后37℃孵育细胞4min。
5．立即去除DMSO shock solution，用完全生长培养基轻轻清洗细胞2次。对于60mm培养皿每次用5mL培养液清洗，100mm培养皿每次用10mL培养液清洗。
6．加入完全培养基到细胞中，根据需要进行后续实验。
 稳定转化：去除生长培养基，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
 瞬时表达：去除生长培养基，加入新鲜的生长培养基。24-72h后收获细胞。

备注：Polybrene的使用浓度依据细胞种类，转染方法等影响，以下使用浓度仅作参考。
1．为提高腺病毒转染效率和LacZ转基因表达，使用6μg/mL Polybrene处理病毒载体后转入BHK-21细胞(MOI为100)，转染率提高到95%，没有用Polybrene处理的只有2.3%转染率。
2．在KSHV(Kaposi"s sarcoma-associated herpesvirus)纯化和转染实验中，浓缩的病毒与8μg/mL Polybrene加到BCBL-1细胞中37℃下孵育2h。
3．在逆转录病毒构建研究中，用v-rasHa 逆转录病毒转染角质细胞(Keratinocytes)后在含有4μg/mL Polybrene培养基中培养3天，病毒滴度为1×107 virus/mL，MOI 为1。
4．在shRNA编码的慢病毒载体的转染研究中，病毒上清中加入8μg/mL Polybrene，转染到HEK293细胞中。
5．在慢病毒shRNA转染研究中，将含有6μg/mL Polybrene的新鲜培养基加入到培养24h的RCC10细胞中，用慢病毒颗粒转染细胞。


可保种型蓝白T载体促销关键词：Blue-White Vector T,可保种型蓝白T载体,BTN60803


·一步法96孔板单菌落质粒DNA提取试剂盒(真空法)
编号：BTN131199
英文名称：One-step 96-wells plate single colony plasmid DNA Extraction Kit
规格：1次

·大肠杆菌TOP10化学感受态细胞
编号：BTN80806
英文名称：E.coli TOP10 Chemical Competent Cell
规格：0.1mL*10
 本产品是采用大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。该菌株是一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重级缺陷的抑制型株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶*基端实现α 互补，可用于蓝白斑筛选。使用pUC19质粒检测，转化效率可达108。本感受态细胞具有链霉素抗性。

菌株的基因型：F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nupG。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入450μl 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项：
1. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

我公司正在打折促销克隆与表达全系列产品，恭候您的咨询选购可保种型蓝白T载体促销。