WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量R

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专业生产供应WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)供应，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)供应
产地：国产|进口
英文名：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(High ROX)
规格：100次
品牌：百奥莱博
  本试剂盒是采用探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0148)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：(WE0149)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：(WE0150)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

 

组份	WE0148-100次	WE0149-100次	WE0150-100次
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	100μl	100μl	100μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事项：
1、本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5、本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。


使用方法：
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)

1、将RNA模板、引物、2×BaldStar TaqMan One Step Buffer、BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系：
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Probe，10μM	0.5μl	0.2μM
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	1.0μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(可选)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常RNA模板的量以10 pg – 100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-PCR反应条件：
 

步骤	温度	时间	循环数
逆转录	45℃	10 min
PCR预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	45 s

注意：
1)1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5-10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

欲咨询购买WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)供应，请致电北京百奥莱博科技有限公司，为您提供最全面周到的产品服务，除此之外，我公司正在促销以下产品：

·新型固定组织基因组DNA提取试剂盒
编号：WE0172
英文名称：NewPurify FFPE DNA Extraction kit
规格：50次
  本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋组织中有效纯化基因组DNA。本品使用专门优化脱蜡剂和裂解液，释放福尔马林固定或组织切片样本中的DNA，不涉及有机试剂二甲*，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除游离DNA的福尔马林交联，有效提高DNA的产量和纯度；优化的缓冲系统使裂解液中的DNA可特异结合到吸附膜上，抑制剂通过两步漂洗步骤有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。同时配置高效微量吸附柱，洗脱体积可低至20μl。经过纯化的DNA可以直接用于PCR、Real-time PCR、SNP基因分型、STR基因分型、二代测序和药物基因组学研究等。
  从福尔马林固定、石蜡包埋样本中分离的DNA分子量通常低于新鲜或冷冻样本中的DNA。DNA片段化的程度取决于样本类型、储存时间以及固定的条件。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTL	15ml
Buffer GL	15ml
Buffer GW1(浓缩)	13ml
Buffer GW2(浓缩)	15ml
Buffer EB	10ml
Buffer DS	10ml
蛋白酶K	25 mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
离心吸附柱DF及收集管	50套
离心管(L-1.5ml)	50个

自备试剂：无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久(＞1年)则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。
2、确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K 的作用。
3、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，以免影响其活性。
4、第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL、Buffer GL和Buffer DS于56℃水浴重新溶解。
6、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入2μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。
7、实验开始前将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃。

操作步骤：

石蜡包埋样本
1、用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织后切成5-10μM的薄片。
2、取约1×1cm2的切片(共约3-8片切片)置于离心管(自备)中，加入160μl Buffer DS，涡旋震荡10秒。短暂离心将样本收集到管底。56℃孵育3分钟，水浴锅中取出后静置，降至室温后进行下一步操作。
注意：如果样品表面暴露在空气中，最初的2-3片弃掉不用。
3、上述管中加入180μl Buffer GTL，涡旋震荡混匀，12000rpm离心1分钟，溶液分为两层。取20μl 蛋白酶K 加入到下层溶液中，移液器小心吹吸混匀。
4、56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。12000rpm离心1分钟，使用200μl枪头沿管壁小心吸取下层的水相于新的离心管中。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
3)如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入2μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置2分钟。

福尔马林等固定液中的样本
1、取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4)，涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，弃上清，重复3次。
2、上述管中加入180μl Buffer GTL，20μl 蛋白酶K ，涡旋震荡混匀。
3、56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
4、12000rpm离心1分钟，使用200μl枪头沿管壁小心吸取上清到新的离心管中。
注意：如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入2μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置2分钟。
5、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀后加入200μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即充分混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3)如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer GL和无水乙醇事先混匀后加样。
6、将步骤5所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱DF中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。
9、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应。
10、将吸附柱置于一个新的1.5ml收集管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-100μlBuffer EB或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。

储存条件：室温(15～30℃)。


WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)供应关键词：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(High ROX),一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料),WE0150


·鼠尾基因组DNA提取试剂盒
编号：WE0186
英文名称：Mouse&Rat Tail Genomic DNA Extraction Kit
规格：50次
  本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的小鼠或大鼠鼠尾中提取高纯度的总DNA。该试剂盒提供的方法简单易行，纯化过程无需*酚或*仿抽提，可获得最大为50 kb的DNA片段，同时对100 bp的片段也能有效回收。本试剂盒采用独特的裂解液，有效裂解鼠尾样本，优化的缓冲体系使裂解鼠尾后产生的DNA高效结合到硅基质吸附柱上，而其他污染物可流过膜；PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可得到高纯度的DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTT	15ml
Buffer GL	15ml
Buffer GW1(浓缩液)	13ml
Buffer GW2(浓缩液)	15ml
Buffer GE	15ml
蛋白酶K	25 mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
吸附柱DM及收集管	50套

自备试剂：无水乙醇

产品特点
1、专用于从大鼠或小鼠的鼠尾中分离纯化高纯度总DNA。
2、无需有机溶剂提取以及乙醇沉淀，彻底去除污染物及下游反应抑制物，快速提取高品质DNA。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4、使用前请检查Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL于56℃水浴重新溶解。

操作步骤：
1、取一段大鼠或两段小鼠长度为0.4-0.6 cm的尾巴，在液氮中研磨成细粉或剪碎放入离心管(自备)中。加入180μl Buffer GTT，振荡混匀。
注意：确保组织的起始量不要超出推荐范围。
2、加入20μl 蛋白酶K ，涡旋振荡，彻底混匀。
3、置于56℃水浴，直至组织溶液完全清澈，一般情况下需要消化6-8小时，孵育过程中涡旋震荡，使样品均匀分散。
注意：1)如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化或再加入20μl 蛋白酶K 消化，不会影响后续操作。
2)如需去除RNA，在上述步骤完成后加入4μl 100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
4、12000rpm(~～13400×g)离心1分钟，以除掉未消化的类似于鼠毛等组织。将上清转移到一个新的离心管(自备)中。
5、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀。加入200μl无水乙醇，涡旋震荡，充分混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
6、将步骤5中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。
9、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
10、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
3)用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
5)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

储存条件：室温(15～30℃)。


WE0150型一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料)供应关键词：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(High ROX),一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料),WE0150


·FITC标记驴抗小鼠IgG(H+L)
编号：WE0360
英文名称：Donkey Anti-Mouse IgG, FITC Conjugated
规格：100μl
本产品为FITC(硫*酸荧光素)标记的经亲和纯化的驴抗体，特异识别小鼠IgG重链和轻链，检测灵敏度高，本底低。荧光素标记抗体广泛应用于免疫学、细胞化学、流式细胞分析等研究，在临床检验上也用于细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。

免疫原：小鼠IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
荧光团：FITC，Amax=492; Emax=520
应用范围：对于大多数实验(1：50-200)

·FastStar热启动DNA聚合酶
编号：WE0122
英文名称：HotStar DNA Polymerase
规格：500U|2500U
  HotStar DNA Polymerase是抗Taq酶单克隆抗体和WE0101 Taq DNA Polymerase的混合制品，适用于Hot Start PCR。使用Taq酶抗体进行PCR扩增时，高温变性前由于Taq酶抗体与Taq酶结合抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。Taq酶抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，DNA聚合酶活性恢复，达到热启动效果。使用本品无需特殊地对Taq酶抗体失活处理，可以在常规PCR反应条件下使用。
  HotStar DNA Polymerase具有5"→3"DNA聚合酶活性和5"→3"外切酶活性，无3"→5"外切酶活性，酶延伸速度2 kb/min，可以扩增长度达5 kb的片段。扩增得到的PCR产物3"端附有一个“A”碱基，因此可直接用于T/A克隆。本产品具有延伸速度快、扩增效率高的特点，主要适用于PCR法扩增DNA片段、DNA序列测定等实验。

产品组成：

组份	500U	2500U
HotStar DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl	5×100μl
10×PCR Buffer	1.8ml	5×1.8ml

注意：本产品的10×PCR Buffer中含有15 mM*离子。

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
HotStar DNA Polymerase,5U/μl	0.25-0.5μl	1.25-2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：可以在室温下配制反应液，须将试剂置于冰上。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	25-35个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
终延伸	72℃	2 min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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