N端测序

——即蛋白质N端氨基酸序列分析技术服务
“Edman降解，蛋白质化学的经典方法，氨基酸序列分析的金标准之一。”



Edman降解法是异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱（TMA）条件下与蛋白质N端α-氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-蛋白质），然后在无水强酸（TFA）条件下，N端的第一个残基从完整的多肽、蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的形式裂解下来，之后在稀酸（25% TFA）条件下，ATZ-AA转化为更加稳定的苯基乙内酰硫脲衍生物，即PTH-氨基酸，生成的PTH-AA输送至高效液相色谱中进行在线分析，剩下的多肽蛋白样品可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-AA，经液相系统色谱柱分离可以确定被测多肽蛋白质供试品N端的氨基酸排列顺序。


技术流程



技术特点

• 可靠性最高的测序方法

■ 对蛋白质多肽样品的纯度要求很高
■ 非标准氨基酸无法测定
分析应用
“Edman降解法N端测序在未知蛋白的测序方面发挥不可替代的作用。”
蛋白质的生物合成均起始于N端，其N端序列的组成对生物学功能有着巨大的影响，例如蛋白质的半衰期、蛋白质在亚细胞器中的定位等等。并且N端可发生多种翻译后修饰，这些也与蛋白质的功能和稳定性息息相关。因此，对于蛋白质N端序列的分析，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。并且随着现代医药工业的发展，出现了大量的蛋白质和多肽类药物分子，对这些蛋白质多肽类药物分子N端序列的分析确认也是医药工业质量控制的重要环节。
技术指标
■ 样品要求：
纯度不低于95%；蛋白质样品N端未封闭；提供样品的相对分子质量；样品含量不低于10 μg。
■ 仪器设备：
全自动蛋白仪·多肽N端测序仪（SHIMADZU型号：PPSQ-33A）
■ 分析软件：
PPSQ-30-Analysis、PPSQ-30-Data processing
色谱柱（WAKO型号：Wakosil-PTH （4.6 mm*250 mm））
■ 实验原理：



Edman降解法原理图
案例分析
案例一：抗体类蛋白质的轻重链分析和N端氨基酸序列测定
样品名称：XXXXXXX理化测定对照品
批号：XXX-XXX-XXXX-X
样品状态：PVDF膜（抗体）
样品重链理论序列为：NH2-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X
谱图结果：



案例二：未知序列蛋白质类样品的N端氨基酸序列分析
样品名称：未知
样品状态：PVDF膜
样品理论序列：未知
谱图结果：

Q&A
1) N端测序仪的介绍。
多肽蛋白质N端测序仪生产制造商主要有美国ABI公司和日本SHIMADZU公司。两家公司的仪器均是基于Edman降解原理进行N端测序，只是在后续的PTH-AA色谱分离条件方面存在差异。随着后来ABI公司逐渐退出N端测序仪市场，相应的仪器也已停产，使得SHIMADZU公司现在成为N端测序仪方面的主要制造商，其主要的N端测序仪型号为：PPSQ-33A、PPSQ-31A。
2) Edman方法和质谱方法的比较介绍。
Edman降解法和质谱分析方法作为现有主要的蛋白质样品N端分析方法，有其各自的优缺点。Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准，已得到广泛应用，但还是存在不足之处，其通量较低，每个残基测试需花费45分钟时间，且每个残基测试的费用成本较高，对于N端封闭的蛋白质样品无法直接进行N端测序。
质谱法分析作为蛋白质样品N端分析的另外一种手段，其通量高，成本相对较低，对N端封闭样品可以进行测试，但其对于未知序列的蛋白质难以做出正确判断，且无法区分分子量相近的氨基酸（I/L、Q/K），所以两种方法蛋白质样品N端测序过程中可以相互进行补充。
3) N端氨基酸测序的样品准备过程。
PVDF膜蛋白质样品可直接进行N端测序。N端测序对样品纯度要求较为严格，如果样品纯度低于95%需进行电泳分离纯化，之后电转印至PVDF膜上进行N端测试。如果样品纯度高于95%，可进行简单处理后进行N端测试，处理过程为：液体样品可直接通过prosorb转移至PVDF膜上，固体样品用0.1% TFA溶液溶解后用相同方法亦转移至PVDF膜上，之后切取样品膜进行测试，如为小肽样品或测试循环数较多（>20）需进行样品固定处理。