T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)北京厂家

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名称：T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)北京厂家
品牌：百奥莱博
编号：YT513
产地：国产|进口
英文名：T4 Polynucleotide Kinase
本酶是一种多聚核苷酸5"羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5"-OH + NTP → 5"-P + NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5"磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5"-P + NDP → 5"-OH + NTP(最适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5"-P + NTP + NDP→5"-P + NDP + NTP。T4 Polynucleotide Kinase同时具有3"磷酸酯酶活性，可催化3"磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3"-P → 3"-OH + Pi(最适pH为5.9左右)。T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。

产品组份：
T4 Polynucleotide Kinase(10U/μl) ——————100U
Reaction Buffer A(10X)————————————80μl
Reaction Buffer B(10X)————————————40μl
24% PEG Solution———————————————40μl

用途：寡核苷酸、DNA或RNA的5"末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5"端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3"磷酸化的单核苷酸的5"磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3"末端连接；去除3"端磷酸基团。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
活性定义：37℃30分钟内，将转移ATP上1 nmol γ-磷酸基团转移到DNA 5"-OH末端所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM 5"-OH DNA，0.05mM ATP，0.1MBq/ml [γ-33P]-ATP。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH7.5)，25mM KCl，0.1mM EDTA，2mM DTT，50% glycerol。
Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应)：500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25℃)，100mM MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA。
Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应)：500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25℃)，0.18M MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA，1mM ADP。
失活或抑制：75℃加热10分钟可使T4 Polynucleotide Kinase失活，加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。
储存条件：-20℃。

注意事项：
1. 铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。
2. PEG可促进磷酸化反应速率和效率；交换反应体系应加入PEG。

使用说明：
1. DNA 5" 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA—————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)———————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)————20pmol
补充无核酸酶的去离子水 ———————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)——————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

2. DNA 5’ 末端磷酸化：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)——————————2µl
0.1mM ATP—————————————————1µl
补充无核酸酶的去离子水 ——————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)—————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

3. 通过交换反应(exchange reaction)进行DNA 5" 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA——————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer B (10X)————————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)—————40pmol
24% PEG Solution ———————————————4µl
补充无核酸酶的去离子水 ————————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)———————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯*(代"仿")抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

4. 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

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·C端CFP标签融合蛋白质粒(青色荧光蛋白)
编号：YT464
英文名称：C-CFP plasmid（with CMV promoter）
规格：1μg
本质粒是哺乳动物细胞表达质粒，用于表达C端含CFP(Cyan FluorescentProtein, 青色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的后面有一个CFP的完整编码序列，因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达C端含有CFP标签的融合蛋白。利用CFP的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位，也可以利用CFP抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。CFP与GFP高度相似，可尝试用GFP抗体检测CFP。该质粒为卡那霉素抗性。转染细胞后，可以使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。


本质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1-602
T3 promoter and T3 primer binding site	620-639
Multiple cloning site	651-740
CFP	741-1460
T7 promoter and T7 primer binding site	1510-1531
SV40 polyA signal	1543-1926
f1 origin of ss-DNA replication	2064-2370
bla promoter	2395-2519
SV40 promoter	2539-2877
Neomycin/kanamycin resistance ORF	2912-3703
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	3704-4162
pUC origin	4291-4958

本质粒(5010bp)的图谱如下：


使用说明：
1. 首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2. 本质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因，构建的质粒可以用常规方法转染细胞。

储存条件：-20℃。


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·增强型CCK-8试剂盒
编号：YT128
英文名称：Enhanced Cell Counting Kit-8
规格：100次|500次|2500次|10000次
本试剂盒是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒，比普通的CCK-8试剂盒具有更好的检测灵敏度和更宽的线性范围。

WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。



WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的增强型CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

WST-8对细胞无明显毒性。加入增强型CCK-8溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

注意事项：
1. 由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
3. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

储存条件：4℃避光，有效期一年。

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