蛋白实验---垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI^-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly^-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：

M_r=K(10^-b·m) logM_r=LogK—b·R_m，

式中 M_r ——蛋白质的分子量；

logK——截距；

b——斜率；

R_m ——相对迁移率。

实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率R_m＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。

三、试剂及主要器材

1．主要试剂

1)标准蛋白混合液

内含：兔磷酸化酶B(Mw 97,400)，牛血清蛋白(Mw 66,200)，兔肌动蛋白(Mw 43,000)，牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和鸡蛋清溶菌酶(Mw 14,400)

2)30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 0.8g,加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。
3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8,定容100mL。4℃冰箱保存
4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL。4℃冰箱保存
5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。

6)10％SDS，室温保存

7)质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制)
8)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。
9)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸

10)脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml双蒸水混合

11)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )

2．实验器材

DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)

电泳仪

长滴管及微量加样器

烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(375px´l125px)

注射器等

四、实验操作

1.装板

将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。

2.凝胶的聚合
分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。

试剂名称	10%的分离胶	5%的浓缩胶
Acr/Bis 30%/ml 分离胶缓冲液（pH8.9）/ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS/ml 10%过硫酸铵/ul 双蒸水/ml TEMED/ul	3.3 3.75 0 0.1 50 4.05 5	0.8 0 1.25 0.1 25 2.92 5

按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿50px处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。

待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。

3．蛋白质样品的处理

若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20mg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20ml的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。

吸取未知分子量的蛋白质样品20ml，按照标准蛋白的处理方法进行处理。

4.加样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法：

用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。

加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15ml(含蛋白质10～15mg)，稀溶液可加20～30ml (还要根据胶的厚度灵活掌握)。

5．电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～50px处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。

6．染色、脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。

7．结果处理
1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。

2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)

相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)
3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。
4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。

五、思考题

聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？

电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？

电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？

上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？

贮液配制及贮存应注意什么？

过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？

附：不同分离胶的配制方法

分离胶的浓度	20%	15%	12%	10%	7.5%
双蒸水/ml	0.75	2.35	3.35	4.05	4.85
1.5mol/L Tris-Hcl(pH8.8)/ml	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
10%SDS/ml	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
凝胶储备液（Acr/Bis）/ml	6.6	5.0	4.0	3.3	2.5
10%过硫酸铵/ul	50	50	50	50	50
TEMED/ul	5	5	5	5	5
总体积/ml	10	10	10	10	10

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