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碱性磷酸酶染色
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晶莱生物
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碱性磷酸酶染色实验技术简介:碱性磷酸酶(AKP)的显示方法最早由Gomeri(1939) 提出,现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ,它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯,对于与磷酸相接的醇基没有特 异性,Gomeri法是让该酶在碱性条件下,分解甘油磷酸钠,产生磷酸根。碱性磷酸酶染色实验技术原理:在一定条件下,使细胞中的酶作用于酶的底物,使其产物在原地进行 捕捉、沉淀转化为有色产物。细胞组织中的碱性磷酸酶在碱性(PH9.0-9.6)环境下使作用液中的底物(a一磷酸萘酚钠)水解,产生出a萘酚,然后再与 偶氮盐偶联,生成不溶性的耐晒染料(最终产物的颜色因所用偶氮盐的品种不同而有所不同)。实验操作流程:1、取材、 固定、包埋、切片;2、取已粘好烘 干的切片两块,放入二甲苯(一)→二甲苯(二)(各3-4分钟)的染缸中进行脱蜡,再经100%乙醇(一)→100%乙醇(二)→95%乙醇→90%乙醇 →70%乙醇→30%乙醇→水。每级各一分钟,在移切片时,用镊子夹住切片震荡并提起,放下反复几次,在移入下一染缸边缘前稍停留,让溶液滴净后,再入下 一染缸,以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸,而影响切片质量;3、将其中一块切片以蜡笔作一标记(用作对照组切片),放入沸水中煮沸5分钟;4、将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟,作用液要事先预热到37°C,水浴中进行;5、取出切片在蒸馏水中洗涤;6、放入硝.酸.钴溶液2-3分钟;7、蒸馏水冲洗干净,否则切片易被污染,影响定位;8、切片浸入硫化铵中2-3分钟;9、蒸馏水冲洗干净;10、经各级酒精脱水。即30%乙醇→70%乙醇→90%乙醇→950%乙醇→100%乙醇(二)→100%乙醇(一),各级一分钟。在显微镜下观察,细胞中有黑色沉淀存在的地方,就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。alp碱性磷酸酶染色
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